咪喹莫特對哮喘大鼠血清TIM-3及肺組織CXCR4表達的影響*

楊麗霞 賈欽堯 蔣莉 董瓊

(1.川北醫學院第二臨床醫學院· 南充市中心醫院呼吸內科，四川 南充637000；2.川北醫學院藥學院藥物研究所，四川 南充637000)

支氣管哮喘是臨床中較為常見的慢性氣道炎癥性疾病，其中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、肥大細胞、氣道上皮細胞等均參與此過程[1-2]。在哮喘的發生及發展過程中，Th17/Treg細胞平衡起到十分重要的作用[2]。相關研究表明[3]，T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白3(T cell immunoglobulin domain mucin domain，TIM-3)是Th17細胞表面特異性有限表達蛋白，其可與Treg細胞表面表達的galectin-9配體特異性結合，在哮喘的發生發展過程中也扮演十分重要的角色。基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)及趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4)是體內重要的趨化因子家族成員，可起到促進血管生成，調節其他細胞因子，趨化炎癥細胞表達，并在哮喘疾病進展過程中起到十分重要作用[4-6]。本研究以哮喘大鼠模型作為研究分析，旨在探討咪喹莫特對哮喘大鼠血清Tim-3及肺組織CXCR4表達的影響。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及材料 選取雌性BALB/C純系大鼠18只，大鼠均為清潔級，4周齡，體質量16～20g。咪喹莫特購自上海特化醫藥有限公司，雞卵白蛋白(OVA，ovalbumin)購自美國Sigma公司。TIM-3及CXCR4檢測配套試劑均購買自大連TAKARA公司。低溫高速離心機5417R(Eppendorf公司，USA)，酶標儀model680(Bio-rad公司，USA)。7900 RT-PCR儀(ABI公司，USA )。

1.2 分組及建模 將所有大鼠依照體質量編號并采用隨機數字表法分為空白組、模型組及觀察組，每組6只。觀察組及模型組大鼠第1d腹腔注射OVA致敏液(400 μg氫氧化鋁凝膠和100μgOVA)0.1ml，1周及2周后各以相同劑量注射致敏液，3周后使用OVA溶液10 g/L超聲霧化激發，每天30 min，持續刺激1周，大鼠均出現毛發豎立、搔鼻、煩躁、精神差、食欲降低、腹肌抽搐、喘息等癥狀。觀察組在霧化吸入1%OVA溶液前先預先吸入咪喹莫特混懸液1.5 g/L 30 min，持續7d。空白組大鼠在模型組處理同期給予生理鹽水干預，21d后使用生理鹽水超聲霧化激發，持續7d。在觀察組大鼠采用咪喹莫特干預后第8d，將各組大鼠處死。

1.3 引物設計 所有引物均由南京金斯瑞公司合成，其引物表見表1。

表1 引物表Table 1 Primer sequences

1.4 酶聯免疫吸附法檢測血清中TIM-3濃度 大鼠干預結束后無菌取心臟采血，離心收集血清使用酶聯免疫吸附法檢測血清中TIM-3水平。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測 建模完成后使用10%水合氯醛麻醉，剝離右肺，采用TRIzol法抽提總RNA水平，采用RT-PCR檢測組織中SDF-1、CXCR4及β-actin mRNA水平，反應體系20μl，其中cDNA模板2 μl，上下游引物各0.3 μl，SYBR 10μl，滅菌超純水7.4 μl，采用RT-PCR法檢測各指標mRNA水平。并取3～4只完整右側中葉支氣管，采用ImageJ測定支氣管管腔內周長、支氣管平滑肌面積、管壁面積、平滑肌細胞核數，將測得值使用所選取的管腔內周長行標準化，后取均值。

2 結果

2.1 支氣管評估結果 空白組、模型組及觀察組大鼠支氣管壁面積、支氣管平滑肌厚度及平滑肌細胞核數均有顯著性差異(P<0.05)；且觀察組大鼠支氣管壁面積、支氣管平滑肌厚度及平滑肌細胞核數均顯著低于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 支氣管相關指標評估結果Table 2 Results of bronchial assessment

2.2 大鼠血清中TIM-3水平檢測結果 3組大鼠血清中TIM-3水平有顯著性差異(P<0.05)，且觀察組顯著低于模型組(P<0.05)，見表3。

表3 大鼠血清中TIM-3水平檢測結果Table 3 Survey results of serum TIM-3 level in rats

2.3 各組大鼠肺組織SDF-1及CXCR4表達檢測結果 3組大鼠肺組織中SDF-1及CXCR4表達有顯著性差異(P<0.05)；且觀察組肺組織中SDF-1及CXCR4表達顯著低于模型組(P<0.05)，見表4。

3 討論

哮喘是較為常見的呼吸道疾病,但其發病機制尚未完全揭示。近年來有研究結果顯示,在哮喘的發生及發展過程中免疫失衡起到十分重要的作用[7-8]。其中輔助性T細胞失衡是導致該病發生及發展的重要因素[9]。此外，輔助性T細胞可能釋放多種細胞因子與氣道高反應性和氣道炎癥密切相關[10-11]。咪喹莫特是近年來研究較廣的新型干擾素誘導免疫調節小分子，其是Toll樣受體7的特異性配體，可被B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及單核細胞抗原呈遞細胞識別。當咪喹莫特與細胞表面特異性Toll樣受體7結合后，可誘導細胞分泌IFN，抑制Th2細胞因子分泌，促進細胞向Th1細胞分化，有效改善以Th2為主的反應，是治療哮喘的重要藥物之一[12-13]。

Table4ResultsofSDF-1andCXCR4expressioninlungtissueofeachgroup

組別nSDF-1/β-actinCXCR4/β-actin空白組60.14±0.010.24±0.02模型組60.75±0.020.67±0.01觀察組60.32±0.020.32±0.02F7.5935.326P0.0000.000

TIM基因是T細胞表面新發現的基因家族成員，而TIM-3是被報道參與T細胞免疫應答成員，其特異性表達在TH17及Th1細胞表面，在T細胞分化過程中起到十分重要的作用[14]。且有研究指出，TIM在自身免疫性疾病、慢性病毒變態反應性疾病過程中均起到十分關鍵作用[15-16]。有研究指出，大鼠與人體內TIM-3具有相同的基因序列，其氨基酸序列與人存63%的同源性[17]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中TIM-3水平顯著高于空白組，經咪喹莫特治療后大鼠血清中TIM-3顯著降低，提示咪喹莫特對哮喘大鼠治療后可有效降低血清中TIM-3水平，提高治療效果。分析原因，可能是咪喹莫特干預后可有效誘導免疫反應，增強樹突細胞抗原呈遞，刺激B細胞分化成抗原分泌細胞，抑制IgE合成的同時增強IgG2α合成，刺激天然免疫而有效調控TIM-3水平，降低體內炎性反應。SDF-1是趨化因子家族成員，其在淋巴細胞、單核細胞、內皮祖細胞、嗜酸粒細胞、造血干細胞等細胞上與CXCR4結合，活化后可調節其他細胞因子表達、趨化炎癥細胞陳述并促進血管生成[18-19]。有學者研究指出，通過分析大鼠哮喘模型氣管壁及肺組織CXCR4及SDF-1水平發現，在哮喘大鼠的氣道重塑和氣道炎癥過程中起到十分重要作用[20]。本研究結果顯示，觀察組大鼠肺組織中CXCR4及SDF-1均顯著升高，而采用咪喹莫特治療后可顯著降低肺組織中CXCR4及SDF-1表達水平。咪喹莫特干預后可有效改善肺組織中CXCR4及SDF-1表達水平，降低氣道炎癥反應，提高肺組織重塑性。分析認為，采用咪喹莫特干預后，可有效抑制杯狀細胞增生，減少粘液分泌量，并改善血管及氣管壁周圍膠原沉積。此外，咪喹莫特還可有效減少肺組織IL-4及IL-5表達量，增強IFN-γ表達，抑制哮喘氣道炎癥反應，進而改善肺組織CXCR4及SDF-1表達。

4 結論

本研究結果發現，采用咪喹莫特對哮喘大鼠干預后可顯著降低血清中TIM-3水平，并改善肺組織中CXCR4表達，具有較高應用價值。但本研究并未對咪喹莫特作用的基因調控方式進行分析，有待后續深入研究。