辛伐他汀對大鼠缺血隨意皮瓣作用時NOS和ICAM-1表達的影響*

劉鴻雁 彭海濤 蔣婷 黃文煉 何清蓮

(川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院燒傷整形美容外科，四川 南充 637000)

在整形外科中，隨意皮瓣的設計遵循長寬比例小于2∶1的原則，頭面部可達到3～4∶1[1]。在皮瓣制備過程中，常伴有不同程度的氧化應激損傷及各種炎性反應，影響皮瓣血管生成，引起部分細胞壞死，降低皮瓣成活率[2]，而缺血再灌注損傷是致其壞死的重要原因之一[3]。采用超比例皮瓣時，常需進行“延遲”二期手術，以改建皮瓣血供達到修復目的。辛伐他汀作為傳統的降血脂藥物，被廣泛應用于高脂血癥的臨床治療。已有大量研究證明，他汀類藥物存在非依賴HMG-COA 還原酶的作用機制，包括誘導凋亡、抑制增殖及對炎癥、內皮功能和血管新生的調節作用等[4-5], 為相關疾病的治療提供了有效途徑。此外，一項實驗證實，他汀類藥物治療可以顯著改善撕裂皮瓣的血液灌注，減少壞死面積，提高了皮瓣的成活率[6]。根據此特性，筆者認為他汀類藥物在未來的整形外科手術中前景廣闊。本研究通過對大鼠腹腔注射辛伐他汀，探討其對大鼠缺血隨意皮瓣作用時NOS和ICAM-1表達的影響，以揭示他汀類藥物影響隨意皮瓣成活的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 選取健康清潔級雄性SD大鼠48只，6周齡，體重(200±20)g，未出現特定病原菌級(SPF級)，購自川北醫學院動物實驗中心。辛伐他汀原粉(批號：sb196-25mg050M4708， Sigma公司，美國)，使用前溶解配成1mg/ml的溶液；大鼠細胞間粘附因子-1(ICAM-1)ELISA 檢測試劑盒、大鼠一氧化氮合成酶 (NOS) ELISA 檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；TS100光學顯微鏡(OLYMPUS,日本)；圖像采集系統；-80℃超低溫冰箱(新飛，中國)；TGL-16型高速電動離心機(江蘇金壇國勝實驗儀器廠)；UV-1601 PC紫外/ 可見光分光光度儀。

1.2 實驗分組及方法 48只大鼠隨機分為實驗組及對照組,每組24只。10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉起效后，參照文獻[7]方法，將大鼠固定于俯臥位，設計蒂部位于尾端、雙側髂嵴連線的8cm×2cm矩形隨意皮瓣，縱軸平行于大鼠長軸，左右對稱。沿設計線切開皮膚、皮下組織，掀起至肉膜深面，徹底止血，確保皮瓣的隨意性，4-0絲線將皮瓣原位縫合,傷口涂抹紅霉素眼膏。手術過程均由同一人在嚴格無菌條件下完成。于術后30min及術后1～7d相同時間點另一人通過腹腔注射給予實驗組辛伐他汀5mg/kg，對照組于同時間點同法給予相同體積生理鹽水。術后7d取材觀察。

1.3 檢測指標

1.3.1 大體形態觀察 觀察大鼠是否存活，皮瓣的色澤、彈性、壞死范圍等情況。術后第7d，兩組分別隨機抽取大鼠8只，拍攝整個皮瓣情況，Image-Plus 6.0圖像分析系統測定皮瓣成活面積及總面積，按公式計算皮瓣成活率。成活率=成活面積/總面積×100%，每只大鼠測量2次，取平均值。

1.3.2 組織學觀察 取皮瓣中軸線大小為8cm ×1cm全厚皮瓣組織，甲醛固定、石蠟包埋，4μm厚切片并進行HE染色。鏡下觀察近、中、遠段(距離蒂部2、4、6 cm 部位)各皮瓣組織結構層次、炎性浸潤程度、毛細血管增生及肉芽組織生長等情況。

1.3.3 NOS和ICAM-1含量測定 測定成活率后，斷頸法處死大鼠，取皮瓣中軸距蒂部4cm處全厚皮瓣，大小為0.5cm×0.5cm，稱重后電動勻漿機制成10%勻漿液，取上清液離心，按說明書檢測皮瓣中NOS、ICAM-1含量。

2 結果

2.1 大體觀察 兩組大鼠無意外死亡，均存活至實驗完成，皮瓣無積血、積液及感染。術后2～3d，兩組皮瓣遠端出現不同程度的紫紅或暗紅區域，界限不清；術后4～5d，兩組皮瓣的遠端出現大小不等、進行性擴大的顏色加深帶；6～7d，遠端黑色壞死范圍趨于穩定，成活皮瓣遠端均有不同程度皺縮，與對照組相比，實驗組變黑壞死區域較小。術后第7d，實驗組皮瓣平均成活率[(63.44±4.30)%]高于對照組[(46.87±6.02)%]，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 組織學觀察 兩組皮瓣的遠段均呈現全層壞死，為焦痂樣改變，組織結構崩解，皮下組織明顯水腫，大量炎性細胞浸潤。對照組：皮瓣近段表皮完整，皮下輕度水腫，輕度炎性浸潤，皮下纖維有增生；中段各層組織結構層次不清，表皮明顯萎縮、變薄，皮下組織水腫明顯，大量炎性細胞浸潤，皮下纖維無明顯增生,見圖1。實驗組：皮瓣近段表皮完整，無萎縮，輕度角化過度，真皮和皮下組織無明顯炎性浸潤，組織無水腫，皮下纖維增生明顯；中段表皮萎縮不明顯，皮下組織輕度水腫，炎性細胞浸潤較輕，皮下纖維組織有增生，并見較多新生血管形成，見圖2。

圖1 對照組中段組織學觀察

Figure1Histologicalobservationinthemiddlepartofthecontrolgroup

圖2 實驗組中段組織學觀察Figure 2 the experimental group

2.3 NOS和ICAM-1含量測定

2.3.1 NOS活性比較 實驗組皮瓣近、中、遠各段在術后7d NOS活性值均大于對照組同段，組間差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組皮瓣NOS活性比較Table 1 The NOS in skin flap of the two groups

2.3.2 ICAM-1含量比較 實驗組皮瓣近、中、遠各段ICAM-1值在術后7d均小于對照組同段，組間差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組皮瓣ICAM-1含量比較Table2 The ICAM-1 in skin flap of the two groups

3 討論

超長寬比例隨意皮瓣具有隨意、靈活、使用方便等特點，已被廣泛應用于整形外科手術中。但是當長寬比例大于2：1 時，皮瓣遠端容易發生嚴重的缺血壞死，致手術失敗[8]。因此，減少隨意皮瓣遠端壞死有利于提高皮瓣成活率，降低二次手術風險，減少圍手術期并發癥。本研究采用改良Mcfarlane皮瓣，皮瓣長寬比例為4∶1，該模型設計蒂部位于尾端，比位于頭端更加穩定[9]，啃食率低，便于觀察，適用于皮瓣成活的干預研究[10]。本研究結果顯示，兩組皮瓣的遠段均發生了不同程度的壞死，但實驗組皮瓣成活率較對照組高，提示缺血隨意皮瓣造模成功。

辛伐他汀作為臨床中常用的他汀類調脂藥物之一，被廣泛應用于調脂治療及冠心病一二級預防，并且療效顯著[11]。越來越多的證據表明，他汀類藥物發揮著降脂以外的作用，能夠抑制炎性因子的表達，降低血清炎癥標志物，對炎性反應過程各階段有著明顯的抑制作用，可非膽固醇依賴性地上調NOS的表達和NO的合成，達到抑制炎癥反應、血小板聚集和血管平滑肌增殖的效應[12-13]。已有研究發現，通過對心肌梗塞的動物模型應用辛伐他汀可明顯減小梗死面積，發揮對缺血心肌的保護作用，但其對皮瓣成活是否具有影響及其可能的機制國內鮮有報道。

實驗證實，氧自由基的大量產生是皮瓣缺血再灌注損傷的重要發病環節。組織的缺血性損傷還可以使激活的白細胞釋放活性氧簇(ROS)。ROS可以與細胞膜脂質、蛋白質以及 DNA 等發生反應，破壞細胞結構，從而損傷神經元[14]。此外，缺血性損傷還可以激活膠質細胞、內皮細胞膜表面的TLR2信號通路，使 NF-κB 的活性上調，促進環氧化酶-2(COX-2) 、IL-17、IL-23、IL-1β、TNF-α 的 表 達，而促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK) 信號轉導通路的激活則進一步促進 IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥介質的合成，加重局部的炎性反應，并引起嚴重的氧化應激，導致細胞死亡[15-17]。皮瓣壞死早期，局部組織的缺血性損傷首先表現為中性粒細胞的浸潤與激活，隨后激活的膠質細胞、巨噬細胞以及血管內皮細胞釋放ROS 、基質金屬蛋白酶 (MMPs) 、誘導性一氧化氮合酶(iNOS) 、TNF-α、IL-1β、細胞間黏附分子( ICAM) 、血管黏附分子( VCAM) 等物質，使氧自由基和有害蛋白酶類發揮破壞作用，遠段皮瓣容易發生壞死。

近年的研究表明，煙酰胺二核苷酸磷酸鹽 ( NADPH) 氧化酶催化 O2轉變為ROS，是血管及神經系統超氧化物的主要來源[18]。NADPH 氧化酶( NOX) 有 5 種亞型，他汀類藥物通過抑制Rac蛋白活性，使下游 NOX1 和 NOX2 活性減弱，減輕由于 NOX 活化導致的細胞損傷。辛伐他汀可以通過抑制 NOX2 蛋白的表達，降低ROS水平，糾正營養障礙模型小鼠的氧化應激、慢性炎癥以及纖維化進程[19]。

此外，他汀類藥物可以通過抗炎癥、抗氧化應激、抗血小板聚集等多種途徑實現對血管內皮屏障的保護，而這些作用被認為可能與其上調內皮型一氧化氮合酶(iNOS) 的活性，增加一氧化氮(NO) 的合成和生物利用度有關[20]。對ApoE基因缺陷小鼠動脈斑塊的研究表明，辛伐他汀可以顯著縮小斑塊內富含脂質的壞死內核，增加斑塊內巨噬細胞、平滑肌細胞的數量，在斑塊局部減少 RAGE 的形成，抑制 NF-κB的激活，使ICAM-1、VCAM-1分泌減少[21]，這與本次實驗結果NOS生成較對照組增多，ICAM-1含量較對照組減少的結果一致，提示辛伐他汀可能通過增加一氧化氮合酶的合成，降低細胞間粘附分子-1的表達，減少中性粒細胞的趨化、黏附和浸潤，減輕白細胞及內皮細胞黏附，從而減輕炎性細胞對內皮細胞及組織的損傷，進而發揮抗炎作用，達到提高皮瓣成活率的目的。

4 結論

本研究結果顯示，圍手術期通過對大鼠腹腔注射辛伐他汀能促進超長寬比例隨意皮瓣的成活，其作用機制可能與增加NOS生成，抑制ICAM-1的表達，進而減輕炎性反應有關。