酶法水解乳清的研究

閆碧軒，馬 玲

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中 030801）

乳清中各種蛋白質成分總稱為乳清蛋白，它具有豐富的營養價值，有很多的功能特性，是最有價值的成分[1]。但乳清蛋白自身的某些性質不利于進一步開發利用，蛋白酶水解主要是克服其性質局限的一種重要處理方法[2]，與堿法和酸法相比，酶法水解植物蛋白條件較溫和，而且產生毒性物質的可能性很小，更重要的是水解效率較高。

經研究，植物蛋白質的水解還可以改善其品質和溶解性、起泡性等功能特性，能夠提高其營養價值[3-4]。堿性蛋白酶水解乳清蛋白后的肽段更容易被人體吸收和利用，而且一些肽段還有某些特殊的生理功能，如降血壓、降膽固醇、抗菌、抗癌、鎮靜等。此外，通過酶法水解乳清蛋白，能夠降低乳清蛋白的致敏性[5]。因此，乳清蛋白的酶法水解處理技術研究和應用具有改善營養、擴大應用范圍的現實意義。試驗研究乳清的水解工藝（包括水解溫度、水解初始pH值、水解時間、底物濃度對滅酶活的破壞等），對進一步擴大乳清的利用具有重要的影響意義。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

乳清，新鮮無抗牛乳制備干酪后所得到的副產物；堿性蛋白酶，山西農業大學畜產實驗室提供；氫氧化鈉（分析純），天津市頂福化工總廠提供。

1.2 試驗設備

pH值自動控制儀，上海海雷磁儀器廠產品；水浴恒溫振蕩器，上海躍進醫療器械廠產品；ALC-210.2型電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳清水解工藝流程

乳清→于80℃下振蕩水浴加熱15 min→調節pH值→降至所需溫度→酶法水解→加熱鈍化→測水解度。

1.3.2 水解度的測定[6]

水解開始時，調節反應體系的pH值為7.0，利用pH自動控制儀實時對反應體系的pH值進行在線控制，以維持反應體系恒定的pH值。每隔一定時間記錄濃度為0.5 mol/L的NaOH堿溶液的消耗量，按下式計算出乳清蛋白的水解度：

DH=B（Mb）（1/α）（1/Mp）（1/h）×100%.

式中：B——NaOH的體積，mL；

Mb——NaOH的濃度，mol/L；

Mp——水解液中蛋白質的質量，g；

h——每1 g原料蛋白質中肽鍵的毫摩爾數，對于乳清濃縮蛋白而言，該值取8.8；

1/α——校正系數（堿性蛋白酶的1/α=1.01）。

1.3.3 試驗設計

影響乳清水解反應的主要因素有水解溫度、初始pH值、酶與底物濃度比和水解時間。先進行單因素試驗，在各單因素試驗結果基礎上，以正交試驗設計優化堿性蛋白酶對乳清蛋白的水解條件。對酶與底物濃度比（A）、初始pH值（B）、酶解溫度（C）和酶解時間（D） 進行正交試驗設計。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 水解溫度對水解度的影響

溫度對酶解反應效率的影響主要在酶催化反應的速度和酶的穩定性2個方面。通常情況下堿性蛋白酶的最適溫度隨著底物的不同而有所不同，但一般都是在50～60℃，將堿性蛋白酶的條件設定在pH值9，酶與底物濃度比（E/S） 0.03，對乳清蛋白水解3.0 h，以水解度為指標，探討不同水解溫度條件下乳清的水解度。

水解溫度對水解度的影響見圖1。

圖1 水解溫度對水解度的影響

由圖1可知，隨著溫度越來越高，水解度越來越大。在40～50℃，水解度上升得比較緩慢；在50～60℃水解度上升的比較快，這個現象主要是因為堿性酶在其最適溫度下，反應物間分子間的接觸更加頻繁，50～60℃酶的活性比較強，反應速度就比較快。水解溫度在60℃時效果最好，但是由于考慮到可能在此溫度水解后，會有美拉德反應以致水解后的產物顏色變深，所以實際選擇的最適溫度為55℃。

2.2 初始pH值對水解度的影響

由結果可知，堿性蛋白酶最適溫度為55℃，設定酶和底物比（E/S） 為0.03，酶解時間3.0 h，水解度為指標。

pH值對水解度的影響見圖2。

圖2 pH值對水解度的影響

由圖2可知，堿性蛋白酶的pH值為8時水解度較低；pH值在8.0～10.0時，水解度隨pH值的增加而加快；當pH值超過10.0時水解度開始下降，水解液的顏色越來越深。堿性蛋白酶在最大活性范圍內，選用較低的pH值會減少反應過程產生的鹽，所以最終選擇pH值為9。

2.3 酶與底物濃度比（E/S）對水解度的影響

由于在試驗中堿性蛋白酶水解時，底物的量是絕對過量的，在決定酶的用量時，相對于酶的濃度，酶和底物濃度比可以更準確地表現酶的反應速率。因此，反應速率是和E/S成正比的。由試驗可知，pH值9，水解溫度55℃的條件合適。

E/S對水解度的影響見圖3。

圖3 E/S對水解度的影響

由圖3可知，E/S為0.03～0.05時，隨著E/S的增大，酶解液的水解度越來越大；E/S在0.05之后，水解度增加很緩慢。所以，從水解度的變化和生產成本綜合考慮，E/S選擇0.05。

2.4 水解時間對水解度的影響

由以上試驗確定的值，設定酶解的條件為水解溫度55℃，pH值9，酶和底物比（E/S） 為0.05，以水解度為指標。

水解時間對水解度的影響見圖4。

圖4 水解時間對水解度的影響

由圖4可知，在整個水解過程中，隨著時間不斷增加，水解度也越來越大，不過每個時間段增加的程度不一樣。在開始的1 h內，水解度增加的最快，主要是由于水解最開始時，堿性蛋白酶主要作用的肽鍵數目最多，隨著水解時間的增加，肽鍵被斷開的越來越多，水解底物中的肽鍵數越來越少，此后水解度增加的程度雖然仍然呈現上升的趨勢，但越來越慢。為節約時間和能源，最終乳清蛋白的最適水解時間為3.0 h。

2.5 乳清水解條件的優化

在單因素試驗結果的基礎上，再對酶與底物濃度比、初始pH值、水解溫度和水解時間4個條件下進行L9（34）正交試驗，確定堿性蛋白酶水解乳清蛋白的最佳工藝參數組合。

正交試驗結果見表2。

由極差分析的結果可知，影響乳清蛋白水解度的因素主次關系為A＞B＞D＞C，即酶與底物濃度比＞初始pH值＞水解時間＞水解溫度。由于堿性蛋白酶水解中，底物是絕對夠量的，水解的程度則完全取決于酶的濃度，因此酶與底物濃度比是影響乳清蛋白水解度最大的因素，其次是pH值，最后是水解時間和水解溫度，由試驗所得和正交分析可知最佳條件參數組合為A1B3C3D3，9個處理組合中水解度最高的也是A1B3C3D3組合，所以堿性蛋白酶水解乳清的最佳條件為水解溫度60℃，pH值10，E/S 0.06，水解時間4 h。

表2 正交試驗結果

3 結論

由于乳清蛋白分子中有較多的疏水氨基酸殘基，因此堿性蛋白酶能對乳清蛋白進行有效的水解。試驗利用了正交試驗對堿性蛋白酶水解乳清的條件進行了研究，主要研究了水解乳清過程中酶與底物濃度比、初始pH值、水解溫度和水解時間對反應的影響，并且對其進行了優化。結果表明，影響堿性蛋白酶水解乳清的因素按影響大小依次為酶與底物濃度比、初始pH值、水解時間、水解溫度。堿性蛋白酶水解乳清的最佳酶與底物濃度比0.06，初始pH值10，水解溫度60℃，水解時間4 h，在以上工藝條件下，乳清蛋白的水解度可達21.92%。