缺氧-復氧促進結腸癌LOVO細胞轉移及其機制的研究

周程繼，王 攀△，喻 晶，魏壽江，王崇樹

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科，四川南充 637000；2.醫(yī)學影像四川省重點實驗室，四川南充 637000)

大腸癌是世界上最常見的惡性消化道腫瘤之一，是導致癌癥患者死亡的第四大原因，腫瘤轉移是導致患者死亡的重要原因[1-2]。已有研究表明，腫瘤缺氧微環(huán)境可促進腫瘤的進展及轉移。而目前對于缺氧-復氧(H-R)腫瘤微環(huán)境在腫瘤轉移方面的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞由于不規(guī)則的微血管網(wǎng)和血流模式，腫瘤細胞亦處于H-R腫瘤微環(huán)境中[3-4]。作者旨在探討H-R條件下能否促進結腸癌的轉移，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)細胞培養(yǎng)和細胞株：人結腸癌LOVO株由陸軍軍醫(yī)大學西南醫(yī)院普外科實驗室凍存保留，復蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)主要試劑和抗體：二亞苯基碘鎓(DPI)為美國Sigma公司產品，一抗鼠抗人基質金屬蛋白酶(MMP)-2單克隆抗體和鼠抗人MMP-9單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Western及IP細胞裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒及預染蛋白質分子量標準購自中國碧云天生物技術研究所，Transwell小室為美國Corning 公司產品，BD Matrigel為美國BD-Bio公司產品。

1.2方法

1.2.1H-R養(yǎng)條件的建立 常氧培養(yǎng)組(N組)：細胞培養(yǎng)在95%空氣、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h作為對照。H-R培養(yǎng)條件參照文獻[5]進行：LOVO細胞在37 ℃，5%CO2和95%N2的混合氣體的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；再將細胞放入95%空氣、5%CO2的培養(yǎng)箱中復氧培養(yǎng)20 h，即完成H-R培養(yǎng)(H-R組)。

1.2.2活性氧(ROS)的檢測 LOVO細胞胰酶消化后，均勻接種培養(yǎng)于96孔板(25×103細胞/孔)，每組設3個重復孔。細胞H-R前分別給予嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制劑DPI 15 μmol/L(H-R+DPI組)和抗氧化劑NAC 30 mmol/L(H-R+NAC組)預處理1 h。ROS的檢測采用熒光探針二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCF-DA)：H-R培養(yǎng)后用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基稀釋DCF-DA至終濃度10 μmol/L，與細胞37 ℃共同孵育20 min后，用無FBS的DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞3次，自動熒光酶標儀(激發(fā)波長488 nm；發(fā)射波長525 nm)檢測細胞內ROS水平。所有測量均在37 ℃進行。

1.2.3傷口愈合實驗 LOVO細胞6孔板內培養(yǎng)至80%～90%近單層融合狀態(tài)，用滅菌的200 μL槍頭分別作3條劃痕(間距約1 cm)，懸浮細胞用PBS洗凈。H-R組傷口愈合實驗：DPI 15 μmol/L、NAC 30 mmol/L分別預處理細胞1 h，再行H-R培養(yǎng)。N組作對照。劃痕處分別在0、24 h拍照，IamgeProPlus軟件計算劃痕愈合面積。

1.2.4細胞侵襲實驗 Boyden小室(每組3小室)檢測細胞侵襲數(shù)目：冷的過濾蒸餾水稀釋基質膠后，均勻加入到8 μm孔徑小室上室。對數(shù)期生長的LOVO細胞胰酶消化后計數(shù)，無血清培養(yǎng)基調節(jié)密度至3×105個/mL，取300 μL細胞懸液加入Boyden小室上部。下室用10% FBS作為趨化物。各實驗組細胞分別給予DPI 15 μmol/L和NAC 30 mmol/L預處理1 h，H-R培養(yǎng)后多聚甲醛固定侵襲細胞30 min后，結晶紫染色。N組常規(guī)進行。光學顯微鏡下(×400)隨機選擇3個區(qū)域細胞計數(shù)，取平均值，并計算相對于N組的百分比(%)。

1.2.5Western blot分析 用EP管收集細胞懸液后，13 000 r/min離心20 s棄上清液，加入600 μL蛋白裂解液冰上裂解30 min，2 500 r/min離心5 min，上清液移入新的EP管中，BCA法測定蛋白濃度，40 μg總蛋白于10%SDS-PAGE分離蛋白，電轉移至硝酸纖維素膜，用含3%BSA封閉液室溫下?lián)u動封閉1 h，4 ℃適當稀釋濃度的一抗MMP-2，MMP-9及GAPDH 孵育過夜，目的蛋白分子量大小采用預染蛋白質分子量標準判斷，化學發(fā)光法(ECL)顯影免疫反應帶進行檢測。

2 結 果

2.1各組LOVO細胞ROS水平比較 相對于N組(99.90±9.79)%，H-R組細胞內ROS水平[(270.51±20.32)%]明顯升高(P<0.01)；H-R+DPI、H-R+NAC組細胞內ROS水平分別為(67.17±7.46)%、(56.53±3.78)%，與H-R組比較均明顯降低(P<0.05)。

2.2各組細胞劃痕愈合面積比較 N組、H-R組細胞劃痕愈合面積分別為(68.73±2.56)%、(83.30±2.67)%，H-R組LOVO細胞的遷移能力明顯強于N組(P<0.05)；H-R+DPI、H-R+NAC組細胞劃痕愈合面積分別為(47.37±4.13)%、(30.91±1.15)%，與H-R組比較均明顯降低(P<0.05)，見圖1。

2.3各組細胞體外相對細胞侵襲數(shù)比較 相對于N組(99.67±4.04)%，H-R組細胞侵襲能力[(168.33±8.08)%]明顯增強(P<0.05);H-R+DPI、H-R+NAC組相對細胞侵襲數(shù)分別為(48.12±2.65)%、(37.33±4.16)%，與H-R組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.4各組LOVO細胞的MMP-2和MMP-9蛋白表達水平比較 與N組比較，H-R組LOVO細胞的MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與H-R組比較，H-R+DPI、H-R+NAC組MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯下調(P<0.05)，見圖3。

A:N組；B：H-R組；C：H-R+DPI組；D：H-R+NAC組

A:N組；B：H-R組；C：H-R+DPI組；D：H-R+NAC組

a：P<0.05，與N組比較；b：P<0.05，與H-R組比較

3 討 論

有研究表明，局部缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的一種重要的共同特征，腫瘤細胞暴露于缺氧條件下的可導致腫瘤惡性表型的轉化，從而促進腫瘤的轉移[6]。LEE等[7]研究發(fā)現(xiàn)，實體腫瘤微血管網(wǎng)和血流模式與正常組織間存在較大的差異，這導致腫瘤細胞亦處于H-R的微環(huán)境中。

在生理情況下，正常細胞在H-R的微環(huán)境中可產生大量的ROS,但產生的ROS可不斷被機體的抗氧化系統(tǒng)清除，不致對機體產生嚴重的組織損傷，從而維持體內氧化還原狀態(tài)的平衡，其依賴于細胞穩(wěn)定的氧化還原系統(tǒng)[8]。但腫瘤細胞由于氧化還原系統(tǒng)的缺陷，對ROS的清除能力明顯降低，從而導致細胞內ROS的持續(xù)升高[9]。而ROS可作為第二信使參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括腫瘤細胞的增殖、分化、遷移和侵襲等多種生物學過程[10]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，H-R條件下LOVO細胞中的ROS水平明顯升高(P<0.05)，在H-R的條件下給予LOVO細胞DPI或NAC處理后ROS的產生明顯減少(P<0.05)。以上研究表明，結腸癌細胞在H-R微環(huán)境中ROS的表達明顯增高，本課題前期研究也得出了類似的結論[5]。同時還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在轉移過程中，必須進行細胞形態(tài)和體積的變化，以使其通過狹窄外間隙而發(fā)生轉移[11]。ROS的上調可能導致細胞形態(tài)的改變和增強細胞的運動能力[12]。此外，ROS所介導的信號通路，如ROS/ERK信號通路在腫瘤細胞遷移中起著重要作用[13]。因此，本課題通過劃痕實驗研究H-R條件下抑制ROS的產生對結腸癌細胞遷移的影響。傷口愈合和侵襲實驗進一步觀察結果顯示，H-R處理后結腸癌細胞的轉移潛能明顯增強，但是這種作用可被DPI或NAC消除，與H-R組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結果表明結腸癌細胞在H-R微環(huán)境中可促進腫瘤的遷移能力，這種促進作用可能是通過提高細胞內ROS的產生而實現(xiàn)。

MMPs幾乎能降解細胞外基質(ECM)中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在癌細胞的侵襲和轉移中發(fā)揮著重要的作用，從而在腫瘤浸潤轉移中的作用日益受到重視，被認為是該過程中主要的蛋白水解酶[14]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的非常重要的兩個成員，二者是導致大腸癌患者腫瘤轉移中的重要因素[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在H-R條件下LOVO細胞MMP-2和MMP-9蛋白的表達明顯上調，結腸癌細胞的侵襲能力明顯增強，從而表明MMP-2和MMP-9蛋白可能參與了結腸癌細胞在H-R微環(huán)境中的侵襲、轉移過程。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，采用ROS的抑制劑DPI和NAC分別處理H-R組細胞后，結腸癌LOVO細胞的MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。因此，本研究認為，MMP-2和MMP-9可作為ROS的下游信號分子參與結腸癌細胞的侵襲、轉移過程，可通過抑制ROS的產生來阻止結腸癌的轉移過程。

綜上所述，H-R腫瘤微環(huán)境在結腸癌的轉移中發(fā)揮著重要的作用，其作用可能是通過提高細胞內ROS的產生而實現(xiàn)，ROS/MMPs信號通路在H-R微環(huán)境中可能對結腸癌的轉移發(fā)揮著重要的促進作用，而其深入的機制還有待進一步的研究。