脫氧核糖核酸酶抑制肺炎鏈球菌青霉素耐藥基因轉移的研究

徐 核，譚艾娟，呂世明

(貴州大學：1.藥學院微生物與生化藥學系;2.生命科學學院;3動物科學學院，貴陽 550025)

細菌耐藥已經成為嚴重的公共衛生危機，可能使人類重新面臨感染性疾病的威脅。“遏制細菌耐藥”已經成為醫學界亟待解決的重大課題[1]。細菌產生耐藥性的機制有很多,其中，耐藥基因通過轉化、接合和轉導在不同細菌間形成水平轉移最為重要[2]。因此，如果能抑制細菌的轉化、轉導和接合，即能抑制細菌耐藥基因的轉移，就可能抑制耐藥菌或多重耐藥菌的形成，為解決目前面臨的嚴峻細菌耐藥問題尋找到一種新的有效途徑和方法[3]。為此本研究旨在以肺炎鏈球菌(streptococcus pneumonia,SP)標準菌株作為受體菌，以青霉素耐藥SP(penecillin resistant SP，PRSP)的DNA作為外源性DNA，以脫氧核糖核酸酶(deoxyribonucleases，DNase)作為抑制劑[4]，通過轉化和抑制轉化實驗，探討DNase在SP轉化過程中抑制SP青霉素耐藥基因轉移的作用，以便為探究DNase抑制PRSP和其他相關耐藥菌的形成提供前期研究，為開發阻斷耐藥基因水平傳播的新型藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 (1)菌株來源：BNCC338425 SP標準菌株購于北納創聯生物技術有限公司。臨床分離的PRSP最低抑菌濃度[(MIC)≥2 μg/mL]，由重慶醫科大學北碚附屬醫院惠贈。(2)主要儀器與試劑：微量移液器購自上海求精生化試劑儀器有限公司。超凈工作臺購自蘇州安泰空氣凈化有限公司。SZ-9Z自動三重純水蒸餾器購自上海亞榮生化儀器廠。LDZX-30FBS立式高壓滅菌鍋購自上海申安醫療器械廠。SH2-82A恒溫振蕩器(搖床)購自常州澳華儀器有限公司。高速臺式離心機(TGL-161)購自上海安亭科學儀器廠。電熱恒溫水槽(DK-8D)購自上海一恒科技有限公司。NanoPhotometer超微量核酸測定儀購自德國的Implen公司。電熱恒溫箱購自上海賀德實驗設備有限公司。FA2004電子天平購自上海精科天平廠。腦心浸液肉湯(BHI培養基)購自貴州鼎國生物技術有限公司。哥倫比亞血瓊脂培養基購自重慶龐通醫療器械有限公司。苯唑西林藥敏紙片購自貴陽宏碩生物科技有限公司。Optochin藥敏紙片購自上海金穂生物科技有限公司。DNase Ⅰ購自北納創聯生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1提取PRSP的DNA并進行相關鑒定 用微量移液器將PRSP保種液200 μL分別加入含1 mL BHI培養基的離心管中，置于37 ℃搖床內振蕩培養13 h(大約為SP生長曲線平臺期的后期)，然后將每管少量的細菌培養液在校正為0.5麥氏比濁度后涂于血平板上并在其內貼上Optochin和苯唑西林藥敏紙片進行SP的培養、生化鑒定和青霉素藥敏試驗，同時將每管內的細菌培養液用煮沸法提取DNA以致每管獲得大約70 μL的DNA提取液,并檢測DNA溶液的濃度和純度。將DNA提取液儲存于-20 ℃冰箱內以備用于轉化實驗和DNase抑制實驗。

1.2.2用外源性PRSP的DNA轉化SP標準菌株并進行相關鑒定 將消毒處理后的SP標準菌株的凍干管移入超凈工作臺內，將0.3 mL無菌水注入凍干管中并吹打以便使凍干菌粉充分溶解成菌懸液，將菌懸液接種至血平板上，置于37 ℃及5%CO2的電熱恒溫箱內培養。待血平板上的菌懸液培養36 h并生長出典型成熟的SP菌落后，依次挑取SP標準菌株的單菌落分別放入含1 mL BHI培養基的20個離心管中，然后將這些離心管隨機分成10個實驗組和10個對照組并置于37 ℃搖床內振蕩培養。當細菌進入感受態時才能易于捕獲外源性DNA繼而發生轉化，而SP的感受態出現在對數生長期的后期，依據SP生長曲線在振蕩培養6 h后才開始進入對數生長期后期，待振蕩培養6 h適時地向實驗組的每個離心管內加入濃度為(87.3±47.3)μg/μL PRSP的DNA提取液140 μL，同時向對照組的每個離心管內加入濃度為0.9%的鹽水140 μL[5]。當細菌群體的生長繁殖處于對數期和穩定期交匯點時，液體培養基內的被轉化和未被轉化的活細菌數已達到頂峰并且細菌轉化窗口已經關閉(SP感受態持續約40 min)[5]，依據SP生長曲線這個交匯點大約為9 h，當振蕩培養9 h實驗組和對照組同時結束培養[6]。然后取實驗組和對照組的每管少量細菌培養液在校正為0.5麥氏比濁度后涂于血平板上并在其內貼上Optochin和苯唑西林藥敏紙片進行SP的培養、生化鑒定和青霉素藥敏試驗。

1.2.3DNase抑制PRSP的DNA轉化SP標準菌株并進行相關鑒定 SP標準菌株的凍干菌粉復活培養與以上相關操作相同，實驗組和對照組的培養容器、培養基、培養的最初菌落數、培養的隨機分組及其他培養條件亦與以上相關內容相同。當實驗組和對照組在搖床內培養6 h時，向實驗組的每個培養管中加入PRSP的DNA溶液140 μL和濃度為18.75 U/μL的DNase溶液100 μL〈溶劑為生理鹽水〉，以及分別向對照組的每個培養管中加入PRSP的DNA溶液140 μL。當振蕩培養9 h時實驗組和對照組結束培養。然后取實驗組和對照組的每管少量細菌培養液在校正為0.5麥氏比濁度后涂于血平板上并在其內貼上Optochin和苯唑西林藥敏紙片進行SP的培養、生化鑒定和青霉素藥敏試驗。

2 結 果

2.1提取PRSP的DNA及相關鑒定結果 在PRSP保種液活化培養后，各培養管細菌的Optochin試驗均顯示陽性，即Optochin紙片的抑菌環直徑均大于14 mm；苯唑西林藥敏試驗顯示各培養管細菌對青霉素不敏感，即苯唑西林藥敏紙片的抑菌環直徑均小于或等于19 mm；從各培養管的細菌懸液中均提取到DNA，即每管DNA提取液的體積約70 μL并且濃度為(87.3±47.3)μg/μL。

2.2PRSP的DNA轉化SP標準菌株及相關鑒定結果 在轉化實驗后，實驗組和對照組細菌的Optochin紙片抑菌環直徑均大于14 mm，Optochin試驗均顯示陽性；在實驗組的苯唑西林藥敏試驗中在每個抑菌圈外均有一個明顯的由低到高直至正常菌落密度的銅錢狀的抑菌環帶，而在對照組的苯唑西林藥敏試驗中在每個抑菌圈外無此特征性的抑菌環帶；實驗組苯唑西林藥敏紙片的抑菌環直徑為(23.3±2.2)mm，對照組苯唑西林藥敏紙片的抑菌環直徑為(33.5±3.0)mm，兩組比較差異有統計學意義(t=-8.74，P<0.01)。原始結果見圖1。

2.3DNase抑制PRSP的DNA轉化SP標準菌株及相關鑒定結果 在抑制轉化實驗后，實驗組和對照組細菌的Optochin紙片抑菌環直徑均大于14 mm，Optochin試驗均顯示陽性；在對照組的苯唑西林藥敏試驗中在每個抑菌圈外均有一個明顯的由低到高直至正常菌落密度的銅錢狀的抑菌環帶，而在實驗組的苯唑西林藥敏試驗中抑菌圈外的抑菌環帶與對照組相比減弱；實驗組、對照組苯唑西林藥敏紙片的抑菌環直徑分別為(29.6±4.7)、(17.6±9.4)mm，兩組比較差異有統計學意義(t=3.60，P<0.05)。原始結果見圖2。

圖1 轉化實驗后對照組和實驗組的Optochin試驗和青霉素藥敏試驗圖片

圖2 抑制轉化實驗后對照組和實驗組的Optochin試驗和青霉素藥敏試驗圖片

3 討 論

由于廣譜抗菌藥的濫用及細菌間耐藥基因的轉移，細菌對常用抗菌藥物耐藥的發展已成為人類健康事業面臨的嚴重問題之一[7]。因此，合理應用抗菌藥物是其主要的應對措施，而開發的新型抗菌藥物不能隨時滿足臨床耐藥菌感染治療的需求[1]，阻斷細菌間耐藥基因轉移的技術和藥物也很匱乏，以致使細菌耐藥危機日趨嚴峻[8]。鑒于細菌間耐藥基因的水平傳播是當今細菌產生耐藥性的重要原因，探尋切斷細菌間耐藥基因水平傳播的新技術和新藥物將是破解細菌耐藥危機的重要途徑之一。為此，本研究以SP標準菌株作為受體菌，以PRSP的DNA作為外源性DNA，以DNase作為抑制劑，通過轉化和抑制轉化實驗，探討DNase在SP轉化過程中抑制SP青霉素耐藥基因轉移的作用，為開發阻斷耐藥基因水平傳播的新型藥物提供新思路。

本研究在提取DNA實驗階段，獲取了含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA提取液。在對PRSP菌株(MIC≥2 μg/mL)培養后，培養后的細菌Optochin試驗顯示陽性和青霉素藥敏試驗顯示不敏感，說明PRSP菌株在培養過程中未被雜菌污染，培養后的細菌仍然是PRSP。用煮沸法從培養后的細菌懸液提取DNA后，DNA提取液的檢測結果顯示從各培養管的細菌懸液中均提取到DNA，表明每管均提取了PRSP的DNA。而據文獻報道，SP臨床菌株對β-內酰胺類抗生素耐藥性與pbp2b、pbp2x和pbp1a基因突變密切相關[9]，其中pbp2x基因突變可介導pbp2b、pbp1a等其他pbps基因突變，pbp2b基因突變導致低水平青霉素耐藥，pbp2b和pbp1a基因突變導致高水平青霉素耐藥[10]。結合以上研究，表明本研究從PRSP中提取的DNA應該含有pbp2b、pbp2x和pbp1a突變基因，符合本研究轉化需要的含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA。

本研究在轉化實驗階段，用含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA提取液，使SP標準菌株轉化為青霉素低敏感的菌株。依據轉化實驗后的Optochin試驗陽性結果，可判斷在轉化實驗過程中實驗組和對照組的SP均未受到雜菌污染；基于轉化實驗后的苯唑西林藥敏試驗結果：實驗組抑菌環直徑小于對照組(P<0.01)，可判斷實驗組的細菌獲得了青霉素低敏感的性狀；根據對照組的對等、同步和專設的作用[11-12]，判定實驗組細菌獲得的青霉素低敏感的性狀不是由非處理因素引起，而是由含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA引起[5]；根據文獻[12]報道可知，實驗組細菌獲得的青霉素低敏感的性狀是SP標準菌株攝入了SP青霉素耐藥基因并成功地重組和表達的結果。實驗組的特征性抑菌環帶也間接地支持上述分子機制，因為只有不同的SP標準菌在轉化實驗過程中攝入不同種類的青霉素耐藥基因并成功地重組和表達，使SP標準菌株轉化為多種青霉素低敏感菌株，才能在抑菌圈外出現銅錢狀的抑菌環帶。

本研究在抑制轉化實驗階段，用DNase抑制了SP標準菌株轉化為青霉素低敏感菌株，顯示DNase具有抑制SP青霉素耐藥基因轉移的作用。基于抑制轉化實驗后的Optochin試驗陽性結果，可推斷在抑制轉化實驗過程中實驗組和對照組的SP均未受到雜菌污染。依據抑制轉化實驗后的苯唑西林藥敏試驗結果：實驗組抑菌環直徑大于對照組(P<0.05)，可推斷DNase抑制了SP標準菌株轉化為青霉素低敏感菌株。根據實驗組的抑菌環帶與對照組相比減弱，也可支持DNase抑制了SP標準菌轉化為青霉素低敏感菌株。由于生物大分子DNase不易進入細菌內，不可能作用于外源性基因的重組和表達，很可能作用于外源性基因的轉移環節，因而DNase的分子抑制機制既有DNase隨機剪切外源性SP青霉素耐藥基因以顯示抑制SP青霉素耐藥基因轉移的效應，又有DNase特異切割SP青霉素耐藥基因調控序列以顯現抑制SP青霉素耐藥基因轉移的功能[13-15]。

總之，DNase具有抑制SP青霉素耐藥基因轉移的作用，是依次通過外源性DNA提取實驗、SP的轉化實驗和SP的抑制轉化實驗而揭示。本研究結果表明，DNase具有阻抑PRSP形成的潛在功能；同時，還表明DNase具有阻抑一些其他耐藥菌形成的潛在作用。本研究結果將為深入研究DNase阻抑耐藥細菌形成和開發阻斷耐藥基因水平傳播的藥物提供前期研究及思路。