丙泊酚對氧糖剝奪導致PC12細胞損傷的保護機制

祁愛花，王愛忠，王 莉

(1.上海健康醫學院附屬第六人民醫院東院麻醉科 201306； 2.上海交通大學附屬第六人民醫院麻醉科 200233)

大腦是體內對缺氧最敏感的器官之一，圍術期缺氧缺血可能導致神經損傷和功能喪失。應激活化蛋白激酶 (SAPK)/Jun 氨基末端激酶 (JNK)被認為是一種應激活化蛋白激酶，可以活化caspase蛋白酶級聯和激活c-Jun磷酸化，并可作為缺氧缺血性腦損傷的早期標志物[1]。因此，SAPK/JNK信號通路是神經藥物保護氧糖剝奪(OGD)損傷細胞的重要靶點。某些藥物(如褪黑素、五味子素A和小檗堿)通過SAPK/JNK信號通路保護OGD損傷的神經細胞[2-4]；然而丙泊酚是否可以通過SAPK/JNK信號通路降低OGD導致的細胞凋亡，迄今仍不明確。本文用丙泊酚處理OGD損傷的神經元樣鼠嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞，通過觀察細胞活力和蛋白表達，探討丙泊酚對神經元樣PC12細胞的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養 PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。將細胞培養在含有5%胎牛血清(Gibco/Life Technologies Ltd.，蘇格蘭)和10%馬血清(Gibco/Life Technologies Ltd.，蘇格蘭)的RPMI-1640培養基(Gibco/Life Technologies Ltd.，蘇格蘭)中，并將其放在37 ℃恒溫、加濕的培養箱中。神經元樣PC12細胞OGD模型：將培養物轉移到無葡萄糖的RPMI 1640培養基中，并置于具有流入和流出閥門的無氧培養箱(S.E.Barburos Metalicos S.A，西班牙)中，然后將箱內注入0.5% O2、5% CO2和95% N2的混合氣體長達48 h。在放入無氧培養箱前1 min，用3種濃度丙泊酚(1、5、10 μmol/L)和10%脂肪乳劑處理細胞。

1.2細胞活力測定 將細胞接種在96孔板中，并通過四基甲偶氮唑藍(MTT)測定細胞活力。細胞在暴露于OGD后1、6、12、24、48 h后，在常規培養基中于37 ℃下與MTT(100 μg/mL)一起溫育。4 h后，洗滌細胞，然后加入100 μL二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶聯免疫吸附測定儀(Life Science)在570 nm監測產物形成。

1.3cleaved-caspase-3免疫細胞化學染色 處理后的細胞在室溫下用4%多聚甲醛(Sigma，美國)固定20 min，并加入0.1%Triton X-100透化15 min。然后將細胞與cleaved-caspase-3抗體(1∶500，Cell Signaling，Danvers，MA)一起孵育1 h。最后用BX-51熒光顯微鏡(Olympus Corporation，日本)在5個隨機選擇的連續區域(5個區域/組)中計數的陽性細胞數目。

1.4Western blot 細胞處理后，4 ℃磷酸鹽緩沖液PBS洗滌并裂解。將總蛋白提取物離心，收集上清液。 使用Bradford蛋白測定法測定蛋白質濃度。樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分離，并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在5%的無脂牛奶中室溫下封閉1 h；在4 ℃下用Bcl-2、cleaved-caspase-3、磷酸化SAPK/JNK和c-Jun的特異性抗體孵育過夜； 并在室溫下與辣根過氧化物酶連接的山羊抗兔免疫球蛋白G孵育1 h。用增強的化學發光(ECL)檢測蛋白質。用Quantity One密度分析軟件(Bio-Rad)定量蛋白質條帶。

2 結 果

2.1PC12細胞形態變化 PC12細胞在未添加7S-NGF的培養液中，生長緩慢，樹突短，見圖1A；添加7S-NGF的細胞培養液將PC12細胞分化為神經元樣細胞株，約95%的細胞新生樹突為細胞體直徑2倍以上，見圖1B。

2.2神經元樣 PC12細胞活性變化 神經元樣PC12細胞OGD損傷12 h后，觀察到約70%的細胞損傷，見圖2A；OGD+5 μmol/L丙泊酚處理PC12細胞12 h后，細胞活力明顯增加(P<0.05)；OGD+10 μmol/L丙泊酚處理PC12細胞12 h后，細胞活力增加最為顯著(P<0.01)，見圖2B。

2.3神經元樣PC12細胞凋亡情況 OGD組凋亡細胞數高于正常對照組(P<0.01)，OGD+丙泊酚組凋亡細胞數低于OGD組(P<0.01)，見圖3A、B。OGD組cleaved-caspase-3的表達明顯高于正常對照組(P<0.05)；OGD+丙泊酚組cleaved-caspase-3的表達明顯低于OGD組(P<0.05)，OGD組Bcl-2的表達明顯低于正常對照組(P<0.05)；OGD+丙泊酚組Bcl-2的表達明顯高于OGD組(P<0.05)，見圖3C、D。

A:光鏡下未添加7S-NGF培養的PC12細胞；B:光鏡下添加7S-NGF培養的PC12細胞

A:神經元樣PC12細胞OGD損傷；B:藥物處理OGD損傷的神經元樣PC12細胞；a：P<0.05，b：P<0.01，c：P<0.001，與0 h組比較；d：P<0.01，e：P<0.05，與OGD組比較

A：免疫細胞化學染色法顯示cleaved-caspase-3陽性細胞；B：隨機選擇的連續區域(5個區域/組)中計數的陽性細胞數目；C：Western blot檢測；D：cleaved-caspase-3和Bcl-2蛋白組間比較；a：P<0.01，與正常對照組比較；b：P<0.05,與OGD組比較

2.4細胞磷酸化SAPK/JNK和c-Jun的蛋白表達水平 OGD組磷酸化SAPK/JNK和c-Jun的表達明顯高于正常對照組(P<0.05)；OGD+丙泊酚組磷酸化SAPK/JNK和c-Jun的表達明顯低于OGD組(P<0.05)，見圖4。

A：Western blot檢測；B：phospho-SAPK/JNK和phospho-c-Jun蛋白組間比較；a：P<0.05，b：P<0.01，與正常對照組比較；c：P<0.05，與OGD組比較

3 討 論

本研究的主要發現是丙泊酚通過抑制SAPK/JNK-c-Jun信號通路在OGD誘導的PC12細胞損傷過程中發揮保護作用。

PC12細胞是研究神經保護藥物的有效模型[5-6]，本文用添加7S-NGF的細胞培養液分化PC12細胞為神經元樣細胞株。95%的細胞新生樹突為細胞體直徑2倍以上，即為分裂后期的神經元樣細胞株，用于實驗。本研究結果表明，神經元樣PC12細胞經OGD處理后細胞活力明顯降低，呈時間依賴性；損傷12 h后，觀察到約70%的細胞損傷，所以選擇12 h用于實驗。

本研究發現，丙泊酚顯著降低OGD誘導的細胞損傷。SHU等[7]也發現高劑量丙泊酚可以減少腦梗死體積和腦水腫，該結果與本文的實驗結果部分一致。但是，孫茫等[8]研究發現，低氧環境下丙泊酚可通過氧化應激損傷增加神經元樣PC12細胞的凋亡，但其具體機制仍不清楚。所以，又進一步觀察了凋亡蛋白caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，結果發現，丙泊酚能明顯抑制cleaved-caspase-3的水平和增強Bcl-2的表達。本研究也對丙泊酚的溶媒脂肪乳劑效應進行了觀察，發現等同于最高濃度(10μmol/L)丙泊酚所含的脂肪乳劑沒有明顯降低OGD導致的細胞損傷，說明丙泊酚保護神經元樣PC12細胞的效應是藥物本身引起的，與脂肪乳劑無關。

本實驗結果表明，丙泊酚降低了OGD誘導的磷酸化SAPK/JNK的表達，這與TABAKMAN等[9]的研究結果相似，他們發現藥物可以通過SAPK/JNK通路阻止OGD誘導的神經元損傷。然而，也有研究報道，藥物保護OGD導致神經元的損傷機制可能是阻斷ERK和p38的激活，但不抑制JNK磷酸化[10]。以上研究顯示，不同的藥物對OGD誘導的細胞死亡發揮不同的保護機制，這些保護機制可能與激活不同轉錄因子有關，如激活轉錄因子2(ATF2)、Ets和c-Jun及胱天蛋白酶級聯。本研究結果顯示，用OGD+丙泊酚處理的細胞中，磷酸化c-Jun的表達水平低于OGD組。實驗證據表明，丙泊酚保護神經元樣PC12細胞的作用與SAPK/JNK-c-Jun有關。

綜上所述，丙泊酚對OGD導致神經元樣PC12細胞損傷的保護作用與SAPK/JNK-c-Jun信號通路有關。這一實驗結果為進一步分析丙泊酚對缺血缺氧造成的神經元損傷的保護作用提供了理論依據。