宮頸癌患者Th1/Th2細胞因子的表達及其預后意義

季 菲，何 艷，楊 麗，丁 巖，杜 蓉

(新疆醫科大學第一附屬醫院婦科，烏魯木齊 830054)

宮頸癌是目前女性患者易發的惡性腫瘤。目前研究認為高危型人乳頭瘤病毒(HPV) 感染可促進宮頸癌病變發生，正常情況下患者具有一定的抵抗病毒感染的能力，但部分患者在HPV的刺激下會產生宮頸上皮內瘤變(CIN)，并可能惡化發展為宮頸癌，這表明患者的免疫功能對宮頸癌的發病有重要的調控作用[1]。患者的臨床癥狀主要表現為經期不調、接觸性出血、陰道炎[2]。因此研究宮頸癌的特異性臨床癥狀與影響臨床預后的因素對患者的治療有重要價值。已有研究表明，T淋巴細胞主導的細胞免疫對機體產生的腫瘤細胞有調控作用[3-4]。輔助性T淋巴細胞(Th)可分泌多種淋巴因子，能增強其他種類的免疫細胞活性，提升機體的整體免疫功能，可以協調細胞毒性T淋巴細胞對免疫反應的抑制作用[5]。本研究通過研究宮頸癌患者血清中Th1/Th2細胞因子與宮頸癌的臨床相關性，以期為宮頸癌患者的臨床治療提供一定的指導，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年6月至2017年6月在本院接受治療的90例宮頸癌患者，患者經術前宮頸活檢證實且在術后通過病理切片分析確診，年齡27～61歲，平均(42.5±9.7)歲。依據國際婦產科聯盟(FIGO)分期標準[6]，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的患者分別是31、37、22例，以患者的臨床分期進行分組。納入標準：(1)入選患者未經放療及化療治療，均為首次在本院確診并接受抗腫瘤治療；(2)患者知情且簽署同意書。排除標準：(1)患者在其他單位確診并接受過抗腫瘤治療；(2)患者合并其他重大代謝疾病，如肝功能異常、糖尿病、心血管疾病等。同時選取本院同期體檢的30例健康女性作為對照組。

1.2主要試劑和儀器 人淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；抗人白細胞介素(IL)-2、IL-4和抗人干擾素(IFN)-γ抗體購自美國eBioscience公司；HPV DNA引物購自上海生工生物公司；AccuriTMC6流式細胞儀購自美國BD公司；超純水系統購自美國MILLIPORE公司；iMark酶標儀購自美國伯樂公司；超低溫冰箱購自日本三洋公司；光學顯微鏡購自德國Leica公司；A550石蠟切片機購自德國MEDITE公司。

1.3方法

1.3.1HPV亞型檢測 取宮頸癌患者的宮頸上皮細胞收集液1.2 mL，以12 000 r/min轉速離心5 min后，加入細胞裂解液120 μL，混勻后100 ℃ 10 min，按照DNA提取說明書分離HPV DNA備用。依據待檢的HPV基因特點(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33)設計相應的PCR引物，采用PCR擴增不同的HPV基因片段，按照HPV分型試劑盒說明書與相應的分型探針雜交，判讀宮頸癌患者感染的HPV亞型。

1.3.2流式細胞術檢測宮頸癌患者外周血Th1/Th2細胞比例 對宮頸癌患者空腹靜脈取血6 mL，并加入EDTA抗凝處理，以1 500 r/min離心10 min，取上清液冷凍保存備用。將離心后的血細胞加入等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)，均勻稀釋后加入淋巴細胞分裂液，1 500 r/min離心20 min，下層為血細胞，上層主要為血漿，中層液體呈白色霧狀，即為單個核細胞層(PBMC)，將其置于37 ℃含5% CO2培養箱培養5 h，分別采用IFN-γ-APC、IL-4-PE-cy5對其進行Th1細胞和Th2細胞表面標記，洗滌后棄上清液，用PBS洗滌2次后，PBS 200 μL重懸細胞，采用流式細胞儀檢測。

1.3.3免疫組織化學試驗 組織標本采用甲醛固定后進行石蠟包埋。對石蠟標本連續切片，厚度為4 μm，溫水展開后置于玻片上，65 ℃烤片30 min，然后依次置于二甲苯和梯度濃度的乙醇中水化，加入抗原修復液后微波爐烘烤15 min，加入3%過氧化氫液阻斷內源性過氧化物，最后采用二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色，最后中性樹脂封片，由經驗豐富的病理醫師評估IL-2、IL-4、IFN-γ水平。

1.3.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清的相關淋巴因子 按照ELISA試劑盒說明書處理樣品，每孔50 μL血清樣品，將反應板在37 ℃孵育60 min。然后采用洗滌液清洗反應板3次后，加入相應酶標抗體試液50 μL孵育30 min，用洗滌液清洗后加入底物工作液50 μL反應20 min，最后加入60 μL終止液，操作酶標儀讀取樣品的吸光度值(A值)。

2 結 果

2.1宮頸癌患者HPV亞型分布 在誘發宮頸癌的前4位HPV亞型感染率方面，宮頸癌患者HPV亞型分布與對照組相比有明顯差異(P<0.05)。不同FIGO分期患者HPV亞型分布有明顯差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組HPV亞型分布特點[n(%)]

a:P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與Ⅰ期比較；c：P<0.05,與Ⅱ期比較

表2 各組外周血中Th1、Th2細胞的比例

a:P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與Ⅰ期比較；c：P<0.05,與Ⅱ期比較

A：對照組；B：Ⅰ期；C：Ⅱ期；D：Ⅲ期；其中分析時采用CD4+細胞設門，FITC-CD4+和PE-IFN-γ+雙陽性細胞即Th1細胞表示。A、B、C和D圖中第1象限百分數表示對照組、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者外周血中Th1細胞的頻率

A：對照組；B：Ⅰ期；C：Ⅱ期；D：Ⅲ期；其中分析時采用CD4+細胞設門，FITC-CD4+和PE-IL-4+雙陽性細胞即Th2細胞表示。A、B、C和D圖中第1象限百分數表示對照組、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者外周血中Th2細胞的頻率

2.2患者外周血中Th1、Th2細胞比例 Th1與Th2細胞比例在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者間比較均差異有統計學意義(P<0.05)。其中Th1細胞在Ⅰ期患者中比例較高(P<0.05)。Th2細胞比例在Ⅲ期患者中比例較高(P<0.05)。見表2，圖1、2。

2.3免疫組織化學方法檢測組織標本中免疫因子的表達 IFN-γ、IL-2在Ⅲ期患者中的陽性率為31.8%、36.7%，較對照組下降較大(P<0.05)；Ⅲ期患者IL-4的陽性率為72.7%，與對照組相比上升較大(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 各組標本組織中IFN-γ、IL-2、IL-4的表達水平檢測[n(%)]

a:P<0.05，與對照組比較

圖3 各組標本中IFN-γ、IL-2、IL-4表達的典型代表圖(×200)

2.4不同FIGO分期患者中各免疫因子表達水平的比較 Ⅲ期患者IL-4水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)；Ⅱ期患者IFN-γ、IL-2水平低于Ⅰ期患者(P<0.05)。不同FIGO分期患者IFN-γ、IL-2水平均低于對照組(P<0.05)，IL-4水平均高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 ELISA檢測各組血清中IFN-γ、IL-2、IL-4的表達水平

a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與Ⅲ期比較；c:P<0.05，與Ⅰ期比較

3 討 論

宮頸癌發病機制較為復雜，主要是患者的遺傳背景和外界生活環境等因素在特定條件下誘發的。Th是可以合成多種免疫因子的淋巴細胞，近年來越來越多的研究關注Th在人體免疫系統發揮的功能。免疫因子在體內可以發揮多種細胞學功能，如促進相關的淋巴細胞分化和成熟[7]。同時各類免疫因子在體內可相互調節和制約，有效穩定體內免疫功能。有研究發現Th2細胞亞群細胞因子水平上升,可干擾體內的細胞免疫功能，使腫瘤細胞發生免疫逃逸。Th1細胞亞群分泌IFN-γ和IL-2，可有效刺激細胞免疫活力，當Th1功能較強時，機體的細胞免疫可有效抑制腫瘤細胞的活力[8]。Th2主要分泌IL-4等細胞因子，可參與體液免疫反應，體內分泌較多的Th2細胞因子后，細胞免疫的抗腫瘤能力受到削弱，Th1/Th2失衡可使腫瘤細胞發生逃避免疫監視，誘發患者病情惡化，通過檢測Th1/Th2細胞因子分泌水平，可分析Th1/Th2細胞亞群功能狀態[9]。因此，探討宮頸癌患者相關淋巴細胞免疫活性的變化可為宮頸癌的治療夯實理論基礎。

目前臨床研究表明，HPV感染和宮頸癌病變密切相關[10]。PENG等[10]發現，宮頸癌組患者高危型HPV感染率可達85.45%，HPV干擾淋巴細胞的正常功能，刺激宮頸上皮細胞的異常增殖。HANPRASERTPONG等[11]研究發現在胃腸道腫瘤患者不同Th細胞比例的變化與癌基因相關的特異轉錄因子表達有密切關系，進而參與調控腫瘤信號通路。孟建華[12]通過流式細胞術，檢測了103例宮頸癌患者外周血中的Th1/Th2比例，發現分化等級較高的宮頸癌患者Th1比例下降，Th2比例上升。本研究發現，Th1細胞比例在Ⅰ期宮頸癌患者中較高，Th2細胞比例在Ⅲ期宮頸癌患者中較高，這與以往研究一致[13-14]。通過免疫組織化學試驗發現IFN-γ、IL-2在Ⅲ期患者中的陽性率分別為31.8%、36.7%，較對照組下降明顯，患者腫瘤分級上升，IFN-γ、IL-2陽性率逐步下降，IL-4陽性率逐步上升。BREBI等[15]在研究宮頸癌前病變和宮頸癌組織中IFN-γ、IL-2等淋巴因子表達水平變化時，發現其與患者病程變長和臨床分期升高呈負相關，這與本研究一致。張曉姍等[16]發現Th1可合成并分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子，可促使免疫功能紊亂，削弱免疫系統對癌細胞的殺傷能力；Th2可合成分泌IL-4因子，促使Th1/Th2細胞因子分泌失衡，引起宮頸上皮細胞分裂周期失控，與本研究結果一致。梁毓等[17]在胃癌患者的外周血中檢測到IFN-γ、IL-2等細胞因子水平的降低，IFN-4水平的上升，刺激患者NK細胞水平下降，從而削弱患者的免疫功能，促進腫瘤細胞生長。有研究表明，IFN-γ、IL-2可調控促癌基因的異常表達，加速癌細胞的增殖[18]。本研究通過ELISA發現Ⅲ期宮頸癌患者血清中IL-4水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)；Ⅲ期患者IFN-γ、IL-2水平低于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)。已有研究發現患有肺癌、乳腺癌或胃癌等腫瘤的患者Th1/Th2比例異常，引起其分泌的免疫因子水平有較大的變化，對腫瘤細胞的生長有較大的刺激作用，可增強其免疫逃避的功能，這表明Th1、Th2分泌的細胞因子與腫瘤異常生長有內在聯系，這與本研究一致[19]。本研究的數據表明，Th1/Th2細胞因子可反映患者的免疫功能狀態，有助于患者的臨床診斷。同時需研究Th1/Th2細胞因子影響腫瘤細胞免疫逃避的具體機制，為相關抗腫瘤藥物開發提供試驗支持。

綜上所述，宮頸癌患者Th1/Th2比例異常，Th1分泌的IFN-γ、IL-2水平下降，Th2分泌的IL-4水平上升，與宮頸癌的病變關系密切，為進一步研究打下基礎。