GRHPR在肝細胞癌組織和細胞中的表達及意義

潘英連,鄧青春,許丹妮,孫華茂,曾江正,陳不尤,盧彥達△

(1.海南醫學院第一附屬醫院腫瘤內科，海口 570102；2.海南醫學院第二附屬醫院婦產科，海口 570102； 3.南通大學醫學院附屬醫院放療科，江蘇南通 226001)

肝細胞癌(HCC)的發病因素很多，除了乙型肝炎病毒(HBV)感染，丙型肝炎病毒(HCV)感染外，還有很多慢性肝臟疾病，如慢性酒精性肝病，非酒精性脂肪肝臟疾病，以及代謝紊亂疾病也是HCC發生與流行的主要因素。其中，代謝綜合征和非酒精性脂肪肝病在癌癥發生過程中沒有肝硬化的表現，引起了人們相當程度的關注[1-3]。目前已經有大量關于代謝產物和代謝途徑異常與HCC發生、發展關系的研究。有研究發現，尿中糖代謝物質可以作為HCC的診斷標志物[4-6]。

乙醛酸還原酶/羥基丙酮酸還原酶(GRHPR)的基因位于人類9號染色體著絲點，人和鼠GRHPR基因結構一致，但是剪切位點存在差異性，并且內含子的區域差異性也較大，在肝臟中表達最高[7-8]。在基因調節和蛋白質相互作用的研究中，與GRHPR相關的主要有過氧化物酶體活化受體α(PPARα)。PPARα參與多種代謝途徑基因轉錄調控，調節過氧化物酶體和線粒體脂肪氧化分解，膽汁酸和氨基酸代謝、葡萄糖穩態、生物轉化、炎癥，齲齒類動物肝癌形成[9]。GENOLET等[10]發現PPARα配體調節齲齒類動物中GRHPR基因表達、肝癌形成，不能調控人類GRHPR的表達。GRHPR具有兩種酶活性：羥基丙酸還原酶(HPR)和D-甘油酸脫氫酶(DGDH)活性，兩種活性維持平衡狀態。NADH/NAD+比例異常是人體代謝異常產生的原因之一[11]。然而生化證據表明GRHPR利用NADPH作為輔酶生成NADP+，為磷酸戊糖途徑提供NADP，為人體提供必需的核糖和多個代謝反應所需的供氫體NADPH[12]。由此可見，GRHPR在細胞糖代謝，能量穩態中發揮著重要作用。

GRHPR既然是存在于肝臟的一種酶，并且參與多個代謝途徑，因此推測它的異常也可能與肝臟疾病具有相關性。在本研究中發現GRHPR在HCC中嚴重減少，在某些病例中甚至缺失。這個發現引起了作者極大的興趣。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1細胞株和主要試劑 人類組織來源肝癌細胞SMMC-7721、Huh7、HepG2、Hep3B細胞及人肝細胞系Lo2均購自中國科學院細胞庫上海保藏中心。DMEM 培養基、胎牛血清購自美國Gibco 公司。細胞總蛋白抽提試劑盒、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體、BCA 蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，兔抗人GRHPR購自SANTA CRUZ公司。

1.1.2組織來源及患者資料 原發性肝癌石蠟標本120份，選自南通市腫瘤醫院，標本均為2003-2006年手術切除標本，病理診斷明確，切緣均大于1 cm，并且有完整的臨床病理資料。標本來源患者中，男96例，女24例，中位年齡49.2歲；肝癌直徑<5 cm 60例，肝癌直徑>5 cm 60例；組織學分化分級：高分化12例，中分化64例，低分化44例；轉移病例(包括淋巴結轉移、門靜脈癌栓和遠處轉移)19例，無轉移病例101例；合并肝硬化98例；HBsAg陽性87例；患者隨訪1～91個月，中位數41.5個月。肝癌及配對的癌旁組織新鮮標本8份，取自南通市腫瘤醫院，用作冰凍切片和蛋白提取，新鮮組織離體后30 min內置于-80 ℃冰箱內保存。所有患者的最終診斷均經兩位病理醫師復診確認。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養條件 Lo2、SMMC-7721、HuH7、HepG2 和Hep3B細胞分別用DMDM、RPMI 1640完全培養基(含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養箱內常規培養傳代。收集處于對數生長期的細胞進行實驗。各項實驗至少重復3次。

1.2.2Western blot法檢測正常肝細胞和HCC細胞中GRHPR蛋白的表達 收集足量的SMMC-7721、Huh7、HepG2、Hep3B和Lo2 細胞，以細胞裂解液提取總蛋白，應用BCA蛋白定量法進行蛋白定量，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉。以兔抗人GRHPR(1∶500) 或β-actin 抗體(1∶500)、辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，電化學發光法顯影并拍照。

1.2.3組織微陣列 將數十個、數百個乃至數千個小的組織片整齊地排列在某一載體上(通常是載玻片)而成的微縮組織切片。

1.2.4免疫組織化學結果判定標準 GRHPR、Ki-67的統計學分析是根據國際半定量Remmele Score方法來進行統計的。統計方法：每個標本組織根據染色強度分為4等(I0為無著色，I1為弱著色，I2為中等著色，I3為強著色)，根據陽性細胞百分比分為5等(P0為無著色，P1為≤10%的陽性細胞，P2為>10%～50%的陽性細胞，P3為>50%～80%的陽性細胞，P4為>80%的陽性細胞)。染色結果=染色強度×陽性細胞百分比。每個結果由2位經驗豐富的病理學者，在電子顯微鏡下計數，若2位病理學者之間存在誤差(P>0.5)時，則要對該標本重新計數。

1.3統計學處理 運用SPPSS11.0統計軟件(Chicago,Ⅲ,USA)，受試者工作特征(ROC)曲線分析找到GRHPR陽性的切點。對GRHPR和Ki-67在HCC中的表達與相應的臨床病理學特征之間的關系采用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析。HCC中GRHPR和Ki-67表達間的相互關系采用Pearson相關分析。Log-rangk檢驗生存曲線統計學差異，Kaplan-Meier分析患者的總體生存率曲線和5年生存率曲線。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1GRHPR在HCC中表達 Western blot檢測8例人肝癌及癌旁新鮮組織中GRHPR表達，在相對分子質量>35×103可以得到GRHPR的清晰條帶，結果顯示：GRHPR在HCC中的表達明顯低于對應癌旁組織，癌旁組織中均可檢測到GRHPR的表達，而對應的癌組織中低表達或缺失表達(圖1)。

T：來自于HCC組織；N：來自于對應的癌旁組織；β-actin：內參對照

2.2GRHPR在HCC細胞株和正常肝細胞株中的表達 檢測正常肝細胞株Lo2和肝癌細胞株Huh7、HepG2、Hep3B、SMMCC-7721中GRHPR蛋白質表達，Western blot結果顯示，GRHPR在肝癌細胞株中有所表達，并且明顯低于正常的肝細胞系(P<0.05，圖2)。

2.3GRHPR在人肝癌及癌旁組織微陣列中的表達 免疫組織化學檢測120例HCC及癌旁組織石蠟切片，結果GRHPR在HCC和癌旁組織中的表達形式，見圖3。表達定位于細胞質，細胞核無定位，染色呈棕黃或棕褐色，細胞核藍色，T+N+：癌和癌旁組織GRHPR均高表達的；T+N-：癌組織高表達而癌旁組織低表達；T-N+：癌組織表達陰性而癌旁組織高表達；T-N-：癌組織和癌旁組織中均呈現低表達。直方圖顯示在癌組織中GRHPR定量計數偏低的病例較多，而在癌旁組織中結果相反(圖4)。箱式圖統計結果顯示在癌組織及癌旁組織中GRHPR表達平均值分別為1.12±0.19和2.04±0.27(P<0.05，圖5)。ROC曲線確定GRHPR表達陽性和陰性切點值為1.53，AUC=0.74(AUC>0.50)，診斷試驗具有準確性(圖6)。

A:GRHPR在不同細胞中的表達；B:灰度值檢測

T+N+：在HCC和癌旁組織中均陽性；T+N-：GRHPR在癌中陽性表達而在癌旁中陰性表達；T-N+：GRHPR在癌中陰性而在癌旁陽性表達；T-N-：GRHPR在癌及癌旁中均陰性

A:HCC組織；B:癌旁組織

圖5 GRHPR在HCC和癌旁組織表達箱式圖

圖6 ROC曲線圖

2.4GRHPR與HCC臨床病理因素的相關性 對進行了免疫組織化學實驗的120例HCC患者的石蠟切片標本進行統計，GRHPR根據ROC曲線最左上角切點值1.53，將其分為高表達組和低表達組，分析GRHPR的表達與肝癌患者臨床病理特征之間的關系。分析顯示HCC組織中GRHPR的表達強度與肝癌患者腫瘤病理分化程度(P=0.003)、腫瘤大小(P=0.015)、甲胎蛋白(P=0.003)、乙型肝炎病毒表面抗原(P=0.010)相關，差異有統計學意義，與患者的性別、年齡、腫瘤結節多少及是否伴有肝硬化狀態無關(P>0.05)；在癌旁組織中，GRHPR與腫瘤大小相關(P=0.01)，與患者的性別、腫瘤結節多少及是否伴有肝硬化狀態等無關(P>0.05)，見表1。

表1 GRHPR蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系(n)

2.5免疫組織化學檢測HCC中GRHPR、Ki-67表達 Ki-67與GRHPR表達結果呈反向趨勢的，GRHPR陰性表達(表達強度評分=0.66)的病例中，Ki-67呈強陽性表達(陽性百分比=0.63)，而在GRHPR強陽性表達(表達強度評分=3.00)的病例中,Ki-67呈弱陰性表達(陽性百分比=0.06)，見圖7。

2.6GRHPR、Ki-67二者相關性分析 根據免疫組織化學的染色結果，Pearson相關系數法分析顯示120例肝癌組織中，GRHPR和Ki67的表達呈負相關(r=-0.870，P<0.05，圖8)。

A、B：GRHPR和Ki67在同一例HCC組織中GRHPR陰性表達，而對應Ki67陽性表達；C、D：同一例HCC組織中GRHPR陽性性表達，而對應Ki67陰性表達

圖8 Pearson相關系數法分析GRHPR和Ki-67表達在HCC中的相關性

2.7GRHPR在HCC患者中生存率的評價 將GRHPR按T+N+，T+N-，T-N+，T-N-分組，經Kaplan-Meier法分析得到HCC患者5年無病生存率：T+N+組生存期為59.8個月(SE 5.7;95%CI：48.6～70.9)，T-N+組49.4個月(SE 4.0;95%CI：41.4～57.4)，T+N-組27.3個月(SE 9.0;95%CI：9.6～44.0)，T+N-組10.1個月(SE 3.2;95%CI：5.9～14.3;P<0.01)。總體生存率T+N+組生存期中位數66.8個月(SE 6.2;95%CI：54.6～79.0),T-N+組56.4個月(SE 4.9;95%CI：47.0～66.0),T+N-組25.0(SE 7.8;95%CI：9.6～40.3)，T-N-組10.0個月(SE 2.1;95%CI：5.9～14.3)，T-N-患者5年無病生存率及總體生存率的顯著降低(P<0.01)，見圖9。

HCC和癌旁組織中GRHPR均陽性表達的T+N+組獲得較高的生存率；GRHPR均陰性表達T-N-組的患者生存率低

3 討 論

最初的研究發現，GRHPR在HCC中和肝癌細胞株中表達較少或缺失。這個發現提示，GRHPR在HCC中表達下降可能不僅僅是一種獨立的表面現象，于是引起了作者進一步關注。進一步發現GRHPR在增殖的細胞中表達下降，并且發現GRHPR與HCC預后有關。

為了探討GRHPR與HCC之間的聯系，首先，通過Western blot檢測8例HCC及相應癌旁組織中GRHPR表達，發現癌組織中GRHPR表達低于癌旁組織，在肝癌細胞株中也獲得一致結論，HCC細胞株GRHPR表達相對于正常細胞株表達少，說明GRHPR在HCC與相鄰的“正常”組織表達存在差異，在腫瘤發生、發展中逐漸表達下降或者缺失。然后采用免疫組織化學方法檢測了120例HCC患者癌及癌旁組織中GRHPR的表達，同樣也得到GRHPR在HCC組織中表達低于相鄰癌旁組織的結論，根據GRHPR在HCC和癌旁表達情況，將患者主要分4個亞類，分別為T+N+、T+N-、T-N+、T-N-，總體頻數分布結果顯示，在HCC中，GRHPR表達強度評分總體偏低，然而在癌旁組織中，GRHPR表達強度評分總體偏高。臨床病理相關分析顯示，在HCC中，GRHPR陽性表達與癌的分化級別，轉移與否，癌灶大小，乙型肝炎病毒表面抗原具有相關性，差異有統計學意義。Ki-67是判斷腫瘤侵襲力和腫瘤預后的有效指標。進一步分析GRHPR表達強度評分與Ki-67表達強度評分呈負相關性，說明GRHPR在HCC中與Ki-67不同，而是腫瘤發展中的一個保護性因素。根據隨訪結果，100例患者中(失訪20例)分4個亞類，即T+N+、T+N-、T-N+、T-N+。從生存時間分析結果顯示：T+N+亞類獲得較好的預后，生存期中位數59.8個月，SE 5.7，95%CI：46.6～70.9；T-N+亞類生存期中位數49.4個月(SE 4.0，95%CI：41.4～57.4;T+N-亞類生存期中位數27.3個月(SE 9.0，95%CI：9.6～44.0)；T-N-亞類生存期中位數10.1個月(SE 3.2，95%CI：5.9～14.3)。總之，GRHPR在HCC中缺失，并與HCC致癌過程相關，可能影響肝癌細胞生長和遷移等生物學行為。

近年研究已經證實代謝性疾病與惡性腫瘤存在共性的機制。在近幾年，隨著人們生活結構改變，代謝性疾病隨之增加，例如非酒精性肝炎、2型糖尿病已經被證實與HCC致病有關[13-15]。本結果顯示，無論GRHPR在癌組織中是否陽性表達，GRHPR在癌旁組織中陽性表達都能獲得較高的生存期。這就表明GRHPR在相對“正常”肝臟組織是十分重要的代謝酶，并且在異常癌組織是患者預后因子之一。這些發現得到了進一步的關注，GRHPR是一種具有兩種活性的酶，即促使HPR活性和DGDH活性。并且，兩種活性維持平衡狀態。因為GRHPR將乙醛酸還原為羥乙酸鹽酶活性異常是導致2型高尿酸血癥的原因。那么，HCC發生、發展可能與2型原發性高尿酸血癥一樣是因為GRHPR的HPR活性異常，也可能GRHPR的D-甘油酸脫氫酶活性發生改變參與肝癌進展中。由于目前本研究是回溯性的研究，有關肝癌發生與代謝性疾病相關的機制有待將來進一步探討。

綜上所述，本文是初步研究GRHPR在HCC中的作用，GRHRP在癌組織中的表達減少，在HCC細胞株中表達量相對正常細胞株表達減少，提示GRHPR在HCC中的表達與“正常”組織具有差異性，提示GRHPR對HCC可能具有診斷價值。分析GRHPR與核增殖指標相關性發現GRHPR與腫瘤的惡性程度和增殖活性呈負相關，提示GRHRP是肝癌的發生、發展的保護性因素。