蠟樣芽孢桿菌對膽汁淤積大鼠的肝損傷和腸黏膜通透性的影響

李永春，王菊平，李小芹△，鄭俊霞

(1.鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院/鄭州兒童醫院消化科，鄭州 450018；2.鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院/鄭州兒童醫院藥學部，鄭州 450018；3.許昌職業技術學院醫學系，河南許昌 461000)

膽汁淤積型肝損傷是由于肝細胞和(或)毛細膽管排泌障礙引起膽汁流出部分或完全阻滯，引起肝臟損傷。膽汁淤積時進入腸道內的膽汁減少，導致腸上皮細胞間緊密連接表達減少，腸黏膜通透性增加，引起腸道功能紊亂、腸源性感染。腸黏膜受損時，腸道內的細菌和內毒素經門靜脈進入肝臟，激活肝內巨噬細胞分泌大量細胞因子，引起炎癥級聯反應，加重肝損傷，形成惡性循環[1]。益生菌能夠調節腸道內菌群生態平衡，改善腸黏膜通透性，有研究顯示其可降低膽紅素，改善肝損傷[2-3]。本研究旨在探索蠟樣芽孢桿菌(bacillus cereus，Bc)對膽汁淤積大鼠肝損傷和腸黏膜通透性的影響，并分析小腸組織中緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達變化，為臨床治療膽汁淤積及相關疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 動物：40只雄性SD大鼠購自河南省實驗動物中心，6～8周齡，體質量180～200 g。試劑：Bc活菌膠囊購自安陽市源首生物藥業有限責任公司；α-荼基異硫氰酸鹽(ANIT)購自美國Sigma 公司；丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、血清總膽紅素(T-BIL)、二胺氧化酶(DAO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；乳酸(LA)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；兔抗Occludin、ZO-1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1造模方法 將40只雄性SD大鼠，按隨機數字表分為對照組、模型組及Bc低、高劑量組，每組10只。除對照組外，其余大鼠均單次灌胃ANIT(50 mg/kg)橄欖油溶液建立大鼠膽汁淤積模型[4]；Bc低、高劑量組于造模次日開始灌胃Bc(1.0×108、2.0×108CFU/kg)，對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，均每天1 次，連續5 d。

1.2.2肝功能和腸黏膜通透性檢測 末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心分離血清，按照試劑盒說明書檢測血清中ALT、AST、DAO的活性和T-BIL、LA水平。

1.2.3肝組織病理檢測 采血后分離大鼠肝臟，取固定部位經中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色后于顯微鏡下觀察肝組織病理學形態。

1.2.4免疫組織化學檢測 采血后取大鼠小腸，常規脫水、包埋，切片，二甲苯脫蠟后乙醇水化，抗原修復后分別滴加Occludin、ZO-1一抗(1∶800)，鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)法孵育二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色后復染，顯微鏡下觀察，細胞質染成棕黃色為陽性細胞。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析Occludin、ZO-1免疫反應陽性的累積光密度值(integrated optical density，IOD)。每張切片隨機取3個視野分析，取其平均值。

2 結 果

2.1各組大鼠肝功能檢測指標比較 與對照組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT和T-BIL水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，Bc高劑量組大鼠血清ALT、AST及T-BIL水平均明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝功能檢測指標比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.2各組大鼠血清LA和DAO水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清LA和DAO水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，Bc低、高劑量組大鼠血清LA和DAO水平均明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清LA和DAO水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

A：對照組；B：模型組；C：Bc低劑量組；D：Bc高劑量組

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.3各組大鼠肝組織病理結果比較 普通光鏡下，對照組大鼠肝小葉結構正常，肝細胞呈整齊的索狀排列，細胞形態正常無變性壞死，匯管區未見炎性細胞浸潤；模型組肝細胞腫脹、空泡樣變形，壞死，細胞排列紊亂，匯管區出現大量的炎性細胞浸潤，局部有膽管增生；Bc低、高劑量組肝組織病理損傷明顯較模型組為輕，肝細胞排列相對正常，少見炎性浸潤，尤其是Bc高劑量組，炎性細胞及肝細胞壞死明顯減少，見圖1。

2.4各組大鼠小腸組織中Occludin、ZO-1的表達水平比較 與對照組相比，模型組大鼠小腸組織中Occludin、ZO-1蛋白表達明顯減少(P<0.05)。與模型組比較，Bc低、高劑量組大鼠小腸組織中Occludin、ZO-1表達均明顯增加(P<0.05)，見圖2、3。

3 討 論

自從馬歇爾提出了“肝腸軸”的概念，肝臟疾病與腸道之間的相互作用就逐漸受到關注[5]。肝內膽汁淤積時排進腸道內膽汁減少，導致腸黏膜上緊密連接表達減少，腸上皮細胞間緊密連接斷裂，腸黏膜屏障受損，通透性增加，腸道內細菌和內毒素移位進入門靜脈系統，激活肝內巨噬細胞分泌大量細胞因子，產生炎癥級聯反應和免疫應答，引起或加重肝損傷。基于肝腸軸的存在，改善腸黏膜通透性、保護腸黏膜屏障可能是治療肝臟相關疾病的切入點[6]。

腸道內的菌群不僅在人體消化吸收、免疫應答等方面發揮作用，其作為肝腸軸的重要媒介，與肝硬化、肝性腦病、膽汁淤積、脂肪性肝病等有關[7]。有研究證實，益生菌可能通過改善腸道菌群、調節腸道屏障功能等機制進而改善患者肝臟功能的作用[8]。本研究顯示Bc可降低膽汁淤積大鼠血清中AST、AST及T-BIL水平，改善肝組織病理，表明Bc具有改善膽汁淤積大鼠肝損傷的作用。

DAO是存在于腸黏膜上層絨毛細胞中具有高度活性的細胞內酶，細胞受損后DAO 進入淋巴管和血液系統，導致血液中DAO 活性增加，DAO是反映小腸黏膜通透性的敏感指標[9-10]。LA是胃腸道固有細菌的代謝產物，哺乳動物不具備將其分解的酶，腸黏膜正常時很少被機體吸收，測定血清中LA水平能夠反映腸黏膜的完整程度和通透性的改變[11]。本研究發現模型組大鼠的血清中LA和DAO水平較對照組大鼠明顯升高(P<0.05)，說明膽汁淤積大鼠的腸黏膜屏障受到損傷，結構受到破壞，Bc干預后，大鼠血清中LA、DAO水平降低，表明Bc可改善大鼠腸黏膜通透性，對腸黏膜屏障具有保護作用。

腸黏膜上皮細胞與細胞間連接形成完整的生物屏障，細胞間連接以緊密連接最為重要，控制著物質跨膜運輸及維持細胞的極性[12]。緊密連接包括Occludin、周膜蛋白緊密連接蛋白家族和Claudin跨膜蛋白家族，Occludin表達于細胞基側膜頂端，與其他蛋白構成緊密連接的基本結構，調控上皮細胞的跨上皮電阻和膜轉運功能[13]。ZO-1則在連接Occludin中起橋梁作用，是Occludin與細胞內骨架系統連接的關鍵物質，對腸上皮起穩定作用[14]。緊密連接表達的改變可能是膽汁淤積時腸黏膜屏障損傷的重要原因[15]。本實驗發現模型組大鼠的小腸組織中Occludin和ZO-1表達水平較對照組大鼠明顯減少，Bc干預后，大鼠小腸組織中Occludin和ZO-1表達增加。緊密連接是腸黏膜屏障完整的基礎，這提示Bc上調大鼠腸黏膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達可能是其改善腸黏膜通透性，進而保護肝損傷的關鍵因素。

綜上所述，Bc可能通過改變腸黏膜通透性、增加緊密連接蛋白表達進而通過肝腸軸對膽汁淤積大鼠肝損傷產生保護作用，然而肝腸之間相互作用復雜，Bc保護肝損傷的具體機制還有待進一步深入研究。