不規則趨化因子在急性肺栓塞后的表達及機制研究

謝小娜，蔡學定

(1.浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院呼吸內科，浙江溫州 325000；2.溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，浙江溫州325000)

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism，APE)后引起嚴重的肺損傷和急性肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PAH)是導致死亡的直接原因。有報道發現，APE后形成的PAH與肺動脈的機械阻塞作用密切相關[1]，甚至認為肺栓塞后血栓的機械阻塞是導致PAH的直接原因。近年來隨著研究的深入還發現，肺動脈機械阻塞嚴重程度與肺動脈壓力的增高有時不成正相關，當機械性阻塞基本解除后，仍發現肺動脈壓力持續升高的現象。此外，有研究結果顯示，APE時大量炎癥細胞聚集浸潤在栓塞血管的周圍，這些聚集稍微炎癥細胞釋放的細胞因子進一步加重肺血管內皮損傷，因此，這些細胞因子在APE性PAH的形成中扮演重要的角色[2]。其中，不規則趨化因子(fractalkine，FKN)又名趨化因子CX3CLl，是趨化因子CX3C亞族的獨有成員，具有可溶和膜結合兩種形式，既有趨化性蛋白的功能也有細胞黏附分子的功能，還具有促進平滑肌細胞增殖的生長因子作用[3]。PERROS等[4]在PAH模型中發現，肺動脈病變周圍的炎癥細胞中FKN表達增加且在血管平滑肌細胞中的表達也明顯增加。本文研究大鼠APE后FKN的表達變化及其機制，從而探討肺栓塞后炎癥反應的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 (1)動物：SPF級健康雄性SD大鼠72只，體質量300～350 g，由溫州醫科大學動物實驗中心生產提供，實驗動物合格證為SCXK(浙)2005-0019。動物置于相同環境和條件飼養。(2)試劑與儀器：BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；DAB顯色試劑盒購自福建邁新生物技術開發有限公司(MXB Biotechnologies)；兔抗大鼠磷酸化p38抗體、兔抗大鼠總P38抗體和山羊抗兔HRP二抗購自美國CST(Cell Signaling Technology)公司；兔抗大鼠FKN抗體購自美國Biolegend公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組 按照完全隨機的方法將72只SD大鼠分為對照組、溶劑組、APE組，每組24只；再將每組分為處理后1、4、8 h 3個亞組，每組8只。

1.2.2APE大鼠模型建立 (1)自體血栓制備:取聚維酮碘棉球對大鼠頸部進行消毒，內徑1.1 mm頭皮針(19G)置入左頸動脈取血并靜置10 min凝血，再將血塊置于37 ℃水中20 min，切成統一規格1.1 mm×3.0 mm的栓子，并用無菌生理鹽水輕柔沖洗3 遍，放入對應試管內，加無菌生理鹽水2 mL，4 ℃冷藏備用，所有操作均為無菌操作。(2) APE模型的建立：使用5%水合氯醛(3 mg/kg)經腹腔注射麻醉大鼠，暴露頸正中線并行縱行切口，分離大鼠頸外靜脈并剪一小口，插入19G聚乙烯導管，通過導管注入之前準備的栓子約50個(不致大鼠死亡)，附以無菌生理鹽水0.6 mL(0.1 mL/min)，血栓伴隨循環血液匯聚并嵌頓于肺動脈，行核素掃描檢測發現栓塞部位核素攝取量明顯減少，證明APE大鼠模型建立成功。對照組不作任何處理；溶劑組大鼠除注入等量的生理鹽水外,余操作同APE組。在成功建立APE模型后，分別于1、4、8 h 3個時間點處死大鼠，經胸腔取大鼠肺組織。

1.2.3免疫組織化學(IHC)檢測 摘取大鼠左肺上葉組織，固定于4%多聚甲醛液24 h，經漂洗、脫水、透明、浸蠟、和包埋后再行切片，通過IHC檢測FKN、p38蛋白的表達。組織切片經脫蠟、水化、封閉及微波修復后，滴加抗FKN抗體(1∶50)或抗p38抗體(1∶50)于4 ℃過夜后，加入山羊抗兔二抗(1∶50)，DAB顯色終止后行蘇木素復染，最終脫水、透明中性樹膠封片。置于顯微鏡下觀察p38、FKN在肺組織中的表達。

1.2.4Western blot檢測p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)表達 稱取各組大鼠等量新鮮肺組織加入細胞裂解液后充分研磨，再經超聲細胞粉碎儀充分破碎，于低溫超速離心機12 000 r/min 4 ℃離心 10 min，取上清液加入等體積2×上樣緩沖液及相應體積PBS充分震蕩混勻并分裝至PCR管經PCR儀維持99 ℃運行5 min，多余蛋白于-70 ℃冰箱保存備用。進行10 mol/L SDS-PAGE(電壓濃縮膠80 V，分離膠120 V)蛋白電泳，電泳后將蛋白轉印至PVDF膜(轉膜電流300 mA，30 min)后用5 g/L 脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，分別加入5%牛血清清蛋白(BSA)稀釋的磷酸化p38單克隆抗體(1∶1 000，兔抗大鼠)和總p38單克隆抗體(1∶1 000，兔抗大鼠) 4 ℃冰箱孵育過夜后，用TBST充分洗滌條帶3 min后，室溫下孵育標記辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗兔二抗(1∶2 000)1 h，再次用TBST充分洗滌3 min，使用ECL試劑顯色及暗室內膠片曝光。使用圖像分析系統對所得條帶進行掃描保存及灰度分析。

1.2.5RT-PCR檢測FKN mRNA表達 使用Trizol試劑盒提取肺組織總RNA并測出A值，A260 nm/A280 nm為1.8～2.0。用日本TakaRa 公司RT-PCR 試劑盒進行逆轉錄擴增，逆轉錄擴增條件:65 ℃ 1 min,30 ℃ 5 min,65 ℃ 15 min,98 ℃ 5 min,5 ℃ 5 min,轉錄成cDNA后，各組取5 μL加入PCR反應體系，PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 1 min，56.2 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環30次。各組PCR產物等量注入2 %瓊脂糖凝膠孔中行水平電泳并在紫外凝膠成像系統下觀察、攝像，隨后進行吸光度值(OD)分析。各樣本的基因表達量計算方法為產物膠上條帶OD與β-action基因條帶OD的比值。

2 結 果

2.1APE大鼠FKN的表達部位 IHC檢測結果顯示，FKN在APE大鼠的肺實質、肺動脈血管壁上均有不同程度的表達；p38在APE大鼠的肺實質、肺動脈血管壁細胞核內均有表達。

表1 各組大鼠各時間點磷酸化P38蛋白OD比值比較

a：P<0.05，與APE組比較

2.2各組大鼠各時間點肺組織磷酸化p38OD比值比較 APE組各時間點大鼠肺組織磷酸化p38OD比值高于對照組和溶劑組(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 各組大鼠處理后8 h磷酸化p38的表達水平

2.3各組大鼠各時間點肺組織FKN mRNAOD比值比較 APE組各時間點大鼠肺組織FKN mRNAOD比值明顯高于對照組和溶劑組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠各時間點FKN mRNA的OD比值比較

a：P<0.05，與APE組比較

圖2 各組大鼠處理后8 h肺組織FKN mRNA的表達水平

3 討 論

3.1FKN在APE后的表達及其作用 FKN是1997 年由BAZAN等[5]在用趨化因子的基因探針檢索表達序列標簽數據庫時發現的，是目前CX3C-類趨化因子中惟一成員，它是含有多個結構域的大分子蛋白,人的FKN基因定位在染色體16q13[6]。膜結合型Fractalkine 存在于活化的細胞表面，主要起著黏附作用；分泌型Fractalkine主要是對單核、NK細胞等具有強有力的趨化作用[7-8]。近年來有報道指出，炎癥反應時，FKN在單核細胞和T細胞募集到血管壁的過程中起重要作用，而且FKN還具有類似于生長因子促肺動脈平滑肌細胞增殖的作用[3]。在APE后，對FKN的研究較少報道。

本研究結果顯示，APE后FKN、p38在肺血管內皮、肺泡上皮、支氣管內皮上有明顯表達(P<0.05)。本研究結果顯示，APE組各時間點大鼠肺組織FKN mRNA的表達量明顯高于對照組和溶劑組(P<0.05)。目前研究認為，APE后PAH的形成可能與栓塞后血管周圍大量炎癥細胞浸潤及其釋放的細胞因子進一步損傷肺動脈內皮有關[9]，而表達增多的FKN對炎癥細胞的聚集起到促進作用。

3.2p38MAPK通路在APE后被激活從而上調FKN的表達 1993年科學家研究發現p38MAPK信號轉導通路，該通路一旦被激活，細胞質中的非磷酸化p38MAPK轉化為磷酸化p38MAPK，再移位到細胞核內[10]。本研究中采用Western blot檢測肺組織磷酸化p38的表達，結果顯示隨時間延長磷酸化p38的表達有明顯增高趨勢(P<0.05)，提示在大鼠APE后，p38MAPK通路被激活。因此本課題組推測，APE后p38MAPK通路被激活，上調了FKN的表達，使得FKN在APE后明顯升高。

此外，有研究報道FKN在PAH的發生、發展中起到重要作用，值得注意的是損傷的內皮細胞可過度表達FKN[11-12]，其是否在APE后PAH的形成中起作用有待進一步研究。也有研究顯示FKN 所引起的趨化白細胞、纖維化、凋亡等均可能是心力衰竭的誘因[13-15]。右心功能不全也是APE后PAH的形成的原因之一。

綜上所述，本研究結果顯示在APE后8 h內，大鼠肺組織中FKN的表達即明顯升高，作為炎癥趨化因子，FKN對APE后肺部炎癥反應有明顯促進作用，從而加重了APE后炎癥反應及PAH的形成。