皺瘤海鞘抗人肺癌A549細胞組分的分離純化及化學成分分析

毛楷林，林 芳，徐 騰，余作挺，周海龍*

（海南大學熱帶農林學院，海南 海口 570228）

腫瘤是人類健康的頭號殺手之一，調查表明每個人一生中患癌癥的機率為22%[1]。多年來研究人員對腫瘤開展了廣泛的研究，但其病因尚未完全確定。而現有的腫瘤治療方法多有較大的副作用，因此尋找新型藥物以及新的藥物靶點是現階段研究人員的主要工作之一。在眾多腫瘤中，肺癌是最常見惡性腫瘤之一，尤其在工業化程度較高的地區，空氣污染情況嚴峻，肺癌發病率呈現逐年上升趨勢。據世界衛生組織國際癌癥研究署估計，2008年全球約有161萬新發肺癌病例，死亡138萬 例，居惡性腫瘤之首[2]。而在我國，肺癌發病率及死亡率也居首位，并且呈現逐年上升趨勢[3-4]。

海鞘是一種脊索動物，廣泛分布于各大海域，品種繁多、形狀各異，并且在韓國、日本等國被作為一種風味食物。皺瘤海鞘是中國南海的優勢種，繁殖高峰期間密度可達到2 225 個/m3[5]。近年來對于海洋天然產物的大量研究表明，海鞘體內存在大量的具有多種生物活性的天然物質，這些物質顯示出多種多樣的生物活性，例如抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎癥、抑制血管生成等[6-8]，其中尤其以抗腫瘤活性最為突出[9-11]，目前有幾種成分已經通過或正在進行臨床實驗，2015年美國食品藥品監督管理局批準在美國上市的抗腫瘤藥物曲貝替定（Trabectedin）就是從加勒比海鞘（Ecteinascidia turbinata）體內提取得到[12]，用于不能手術切除或特定的晚期軟組織肉瘤的治療。皺瘤海鞘由被囊及內臟團兩部分組成，被囊較為堅韌且具有韌性，能夠抵御環境的變化；內臟團呈現橙紅色，柔軟且富含水分。以往多將海鞘作為一個整體來研究，而本課題組前期的結果表明，海鞘被囊與內臟團提取物的生物活性差異很大，所含的物質成分也迥然不同[13]，因此本實驗將海鞘分為被囊及內臟團兩個部分進行研究。

海鞘目前被認為是一種污損生物，不但不具有經濟價值，還與水產養殖動物競爭養分，對水產養殖造成損失。因此，通過對皺瘤海鞘進行系統的開發研究，生產出具有高附加值以及廣闊市場前景的產品，可以極大地減少海鞘資源的浪費，同時增加水產養殖戶的收入。本實驗通過現代提取及純化技術對皺瘤海鞘不同部位進行提取，得到具有較高抗腫瘤活性的皺瘤海鞘組分，為進一步開發海鞘功能產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺瘤海鞘于2016年9月采自海南省陵水縣黎安鎮港口，根據《中國海洋生物圖集》（第七冊）對其種類鑒定為皺瘤海鞘（Styela plicata）。人肺癌A549細胞由海南大學熱帶農林學院分子藥理學實驗室提供。

DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸、青霉素鏈霉素混合液 美國Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；四氮甲唑藍（thiazolyl blue，MTT） 美國Amersco公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒 杭州聯科生物技術股份有限公司；柱層析硅膠、薄層層析硅膠板青島海洋化工廠；其他有機溶劑（均為分析純） 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

R210旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司；Multiskan FC酶標儀、HEPA class 100 CO2培養箱 美國Thermo Scientific公司；H1850R低溫高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SCIENTZ-10N多歧管普通型冷凍干燥機 寧波新芝凍干設備股份有限公司；FACS-CANTO II型流式細胞儀 美國BD公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；DM6000熒光顯微鏡德國LEICA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將皺瘤海鞘樣品用自來水洗凈，去除表面附著物，剪開被囊取出內臟團，將被囊與內臟團分別于冷凍干燥機中凍干72 h后放入粉碎機中粉碎至40 目，粉碎過程中控制溫度不超過50 ℃。

1.3.2 甲醇提取物的制備

分別稱取皺瘤海鞘被囊粉與內臟團粉各15 g于250 mL錐形瓶中，加入150 mL甲醇，放入攪拌子，將錐形瓶放于磁力攪拌器上室溫攪拌48 h。用0.45 μm有機系濾膜過濾，將上清液收集于另一玻璃瓶中。向濾渣中再次加入100 mL甲醇，同法處理2 次。合并3 次提取液。用旋轉蒸發儀于40 ℃下減壓蒸發至浸膏質量不再變化，將被囊浸膏和內臟團浸膏分別收集至5 mL離心管中，放入4 ℃冰箱備用。

1.3.3 硅膠柱層析分離

在43 cm×3 cm的層析柱內加入100 g柱層析硅膠，采用濕法裝柱，之后將2 g左右的海鞘被囊甲醇提取物（tunic methanol extract，TME）或內臟團甲醇提取物（visceral methanol extract，VME）與硅膠填料拌勻上柱，按照如下順序洗脫：100%（體積分數，下同）正己烷；75%正己烷-二氯甲烷溶液；50%正己烷-二氯甲烷溶液；25%正己烷-二氯甲烷溶液；100%二氯甲烷；75%二氯甲烷-甲醇溶液，50%二氯甲烷-甲醇溶液，25%二氯甲烷-甲醇溶液；100%甲醇。每份洗脫液300 mL，在洗脫過程中用薄層色譜檢測是否已經洗脫完全，如果未洗脫完全，仍然可以繼續洗脫。將薄層色譜檢測為成分相同的洗脫液合并，40 ℃減壓濃縮至干，稱質量。

1.3.4 腫瘤細胞培養

A549細胞加入含有質量分數10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基中，放置于37 ℃、5%二氧化碳的細胞培養箱中培養，每周傳代2 次，取對數生長期的細胞進行實驗，傳代次數不超過15 次。

1.3.5 MTT法檢測細胞相對存活率

用移液器將細胞懸液加入表面處理過的96 孔細胞培養板中，每孔100 μL。細胞貼壁后去除培養液，加入樣品溶液，放入培養箱48 h。向樣品溶液中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制），放入細胞培養箱孵育4 h。倒去液體，每孔加入150 μL DMSO，在室溫、避光條件下輕柔振蕩培養板1 h。用酶標儀測定490 nm波長處OD值。實驗設A549細胞陰性對照組、陽性藥物對照組以及調零組。陽性藥物對照為5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），質量濃度20 μg/mL；陰性對照加入與最大供試藥物相同質量濃度的DMSO（藥物溶劑），細胞數量與其他孔相同；調零孔加入相同體積的DMEM培養基（無細胞）。實驗組樣品每個質量濃度（0（空白組）、25、50、75、100、200、300、400 μg/mL）設5 個平行孔。96 孔板進行實驗前在邊緣孔都加入100 μL的無菌PBS，防止產生邊緣效應。細胞相對存活率按式（1）計算。

式中：ODT為樣品孔OD值；ODZ為調零孔OD值；ODN為陰性對照孔OD值。

1.3.6 半數抑制濃度的測定

用無血清細胞培養基配制質量濃度從低到高的6 種樣品溶液（31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μg/mL），并設陰性對照組（加入與樣品溶液最大質量濃度相同的DMSO（藥物溶劑），細胞數量與其他孔相同），孵育細胞24 h，用1.3.5節MTT法檢測細胞活力，并用GraphPad prism 6.0軟件計算半數抑制濃度。

1.3.7 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態

將A549細胞置于6 孔細胞培養板中培養，加入不同質量濃度（80、160、320 μg/mL）的樣品溶液，同1.3.6節設置陰性對照組，培養48 h后將培養板置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.8 細胞凋亡觀察與分析

細胞經過樣品（質量濃度0（空白組）、80、160、320 μg/mL）處理48 h后，使用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒檢測A549細胞的凋亡。首先用不含乙二胺四乙酸的細胞消化液消化處于對數生長期的A549細胞，收集（1×106）～（3×106）個細胞，用預冷的PBS離心洗滌兩次，棄上清液。加入500 μL凋亡陽性質控液重懸，置于冰上孵育30 min。用預冷PBS離心洗滌，棄上清液。加入適量4 ℃預冷的結合緩沖液重懸，并加入數量相同且未經處理的活細胞與之混合。加入4 ℃預冷結合緩沖液補充至1.5 mL，等分成3 管，其中一管為空白對照，另兩管為單染管。單染管分別加入5 μL Annexin V-FITC或10 μL PI，室溫避光孵育5 min。在流式細胞儀上，用空白管調節前向散射光、側向散射光和熒光通道的電壓，并在此電壓條件下用單染管調節熒光通道的補償。離心收集（1×105）～（5×105）個細胞，取500 μL結合緩沖液重懸細胞。每管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI。輕柔漩渦混勻后，室溫避光孵育5 min。在流式細胞儀上，通過FITC檢測通道檢測Annexin V-FITC，激發波長Ex＝488 nm，發射波長Em＝530 nm；通過PE檢測通道檢測PI。同時，滴加20 μL用Annexin V-FITC/PI雙染的細胞懸液于凹槽載玻片上，并用蓋玻片蓋住細胞，在熒光顯微鏡（200×）下觀察腫瘤細胞的形態變化和染色結果。

1.3.9 GC-MS檢測高活性組分的化學成分

1.3.9.1 GC條件

色譜柱：Hp-5ms毛細管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：前進樣口吹掃流速3 mL/min，起始柱溫80 ℃，保持2 min，以6 ℃/min的升溫速率升至300 ℃，保持20 min；進樣口溫度250 ℃；載氣（He）流速1 mL/min；進樣量1.0 μL，分流進樣，分流比：5∶1。

1.3.9.2 MS條件

電子轟擊離子源；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；傳輸線溫度260 ℃；離子源溫度250 ℃；掃描范圍m/z 20～450。質譜檢測結果利用MS數據系統（NIST 2008）檢索匹配對應的化合物，每種化合物的相對含量由儀器軟件得出。

1.4 數據統計分析

使用SPSS 20軟件處理數據，MTT檢驗數據來自5 次平行實驗。結果用±s表示，用單因素方差分析進行統計分析，采用最小差異顯著法進行顯著性比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 皺瘤海鞘TME和VME對A549細胞增殖的影響

圖1 皺瘤海鞘甲醇提取物對A549細胞增殖的影響Fig.1 Effects of methanol extracts from Styela plicata on the proliferation of A549 cells

不同質量濃度的皺瘤海鞘TME和VME作用于A549細胞后，對細胞的存活率均具有一定影響。由圖1可知，TME以及VME在低質量濃度（25～75 μg/mL）條件下孵育，對于細胞的增殖沒有抑制作用；隨著提取物質量濃度的增大，細胞相對存活率均明顯下降。100 μg/mL VME處理細胞48 h后，細胞相對存活率僅為27.85%，低于陽性藥物對照組（37.80%）。而隨著VME質量濃度繼續增加，細胞相對存活率沒有繼續下降，反而有升高趨勢，表明100 μg/mL是VME抑制A549細胞的最佳質量濃度。TME在100～400 μg/mL范圍內，隨著質量濃度的增大，細胞相對存活率降低，最低達到48.75%，表明TME抑制A549細胞相對增殖具有劑量-效應關系。

2.2 皺瘤海鞘TCEF和VCEF對A549細胞增殖的影響

圖2 皺瘤海鞘甲醇提取物硅膠柱層析組分對A549細胞增殖的影響Fig.2 Effects of different silica column chromatographic fractions from the methanol extracts on the proliferation of A549 cells

由圖2可知，被囊柱層析組分（column eluted fractions from tunic extract，TCEF）及內臟團柱層析組分（ column eluted fractions from visceral extract，VCEF）作用于A549細胞后，對細胞相對存活率具有一定影響。用100 μg/mL TCEF-1～7孵育A549細胞后，對細胞相對存活率沒有明顯抑制作用，而TCEF-8、9對細胞有顯著抑制作用，孵育48 h后細胞相對存活率分別為66.57%及71.26%。從整體水平上看，VCEF對于A549細胞的抑制作用明顯強于TCEF，其中，VCEF-3、5、6、7、9對于A549細胞的相對抑制率都在40.00%以上，尤其是VCEF-6作用于細胞48 h后，細胞相對存活率僅為25.75%，抑制作用強于陽性藥物對照組（37.80%）。

2.3 VCEF-6處理對A549細胞半數抑制濃度的影響

圖3 VCEF-6抑制A549細胞增殖的半數抑制濃度曲線Fig.3 Half inhibition concentration curve of VCEF-6 on the proliferation of A549 cells

由圖3可知，VCEF-6對于A549細胞的抑制具有明顯的劑量-效應關系，24 h半數抑制濃度為168.7 μg/mL，表明VCEF-6具有較強的抑制A549細胞活性。

2.4 細胞形態學觀察結果

圖4 倒置相差顯微鏡對A549細胞觀察結果（×200）Fig.4 Morphological changes of A549 cells under an inverted phase contrast microscope (× 200)

如圖4所示，陰性對照組的A549細胞生長良好，細胞形態規則，邊緣清晰平整并且排列緊密。VCEF-6作用48 h后，細胞增殖明顯受到抑制，細胞密度比陰性對照組減小，80 μg/mL VCEF-6處理組A549細胞出現膜皺縮，形態不規則；160 μg/mL VCEF-6處理組細胞輪廓模糊，貼壁性下降；320 μg/mL VCEF-6處理組細胞空泡化嚴重，細胞皺縮程度也急劇增加，與陰性對照組正常細胞有明顯區別，同時在培養基中出現許多懸浮的死細胞。

2.5 細胞凋亡觀察與分析結果

細胞凋亡是細胞為了維持內環境的穩定，由細胞內基因控制其發生的有序的、自主的死亡。誘導腫瘤細胞凋亡是目前所有癌癥治療手段中最有效的手段之一，而凋亡敏感性的喪失是細胞由正常狀態轉變為癌化狀態的主要標志之一。何雅軍等[14]的研究表明，Annexin V-FITC/PI雙標記染色法能夠準確地反映細胞凋亡的過程，可作為檢測早期細胞凋亡的方法。本實驗以Annexin V-FITC/PI雙染料對VCEF-6處理的A549細胞進行染色，通過流式細胞儀及熒光顯微鏡對染色的腫瘤細胞進行細胞凋亡觀察與分析。顯微鏡觀察發現大部分被VCEF-6處理的細胞與Annexin V-FITC/PI染料結合后，呈現綠色和紅色，表現出典型的凋亡特征。而未被VCEF-6處理的細胞幾乎沒有與Annexin V-FITC/PI染料結合。隨著VCEF-6質量濃度的增大，早期凋亡與晚期凋亡的細胞數量也發生變化。80 μg/mL及160 μg/mL質量濃度下被FITC染色的細胞相對較多，表明在這兩個質量濃度下早期凋亡細胞所占例比較高。而當VCEF-6質量濃度增大到320 μg/mL時，被PI染色的細胞相對增多，表明在該質量濃度下晚期凋亡細胞占比較多（圖5C）。通過流式細胞儀檢測結果發現，隨著VCEF-6質量濃度的增大，能與Annexin V-FITC/PI結合的被V C E F-6處理的A 5 4 9細胞也增多（圖5A）。VCEF-6質量濃度從0 μg/mL時增大至320 μg/mL時，A549細胞的總凋亡率（早期凋亡率（Q2象限）與晚期凋亡率（Q4象限）之和）從13.30%增加到30.27%（圖5B），表明VCEF-6具有促進腫瘤細胞凋亡的作用。

圖5 VCEF-6質量濃度對A549細胞凋亡的影響Fig.5 A549 cell apoptosis induced by different concentrations of VCEF-6

2.6 VCEF-6的化學成分分析

圖6 VCEF-6的GC-MS總離子流圖譜Fig.6 Total ion current chromatogram from GC-MS analysis of VCEF-6

表1 VCEF-6化合物成分分析Table1 Chemical composition analysis of VCEF-6

經過MS數據系統檢索（NIST 2008）以及人工譜圖解析確定出VCEF-6的化學成分，結果見圖6、表1。從VCEF-6中共檢測并鑒別出22 種組分，包括烷烴類6 種、甾醇類6 種、脂肪酸酯類6 種、芳香族化合物4 種。其中相對含量大于1%的有膽甾醇（34.46%）、麥角甾-5,22-二烯-3-醇（3.82%）、鏈甾醇（2.00%）、豆甾-5,24（28）-二烯-3-醇（1.98%）、穿貝海綿甾醇（1.94%）、十六酸甲酯（1.90%）、豆甾醇（1.44%）、硬脂酸甲酯（1.43%）。

3 討 論

近年來，海鞘在抗腫瘤天然產物的研究中脫穎而出，在首先進入臨床階段的6 個海洋來源的抗腫瘤藥物中，3 個來源于海鞘，此外還有大批候選化合物也正在研究中。Liberio等[15]從143 種海鞘提取物中鑒定出一種雙吲哚生物堿eusynstyelamide B，對于乳腺癌細胞MDA-MB-231的半數抑制濃度僅為5 μmol/L。Palanisamy等[16]利用高效液相色譜法分離出皺瘤海鞘甲醇提取物的不同組分，并分別檢測其對腫瘤HeLa細胞的抑制活性，其中SP-50組分抑制腫瘤細胞生長最為明顯，半數抑制濃度僅為33 μmol/L；值得注意的是，SP-50對于人正常細胞BJ-EHLT沒有顯著的毒性，表明該組分對于腫瘤細胞的抑制具有選擇性，亟待進行深入研究。2012年，一種來源于Ciona savignyi海鞘的抗腫瘤多肽CS5931被分離出來，其對于HeLa、A549細胞的半數抑制濃度分別為18.132 mg/mL和105.732 mg/mL，進一步的研究表明，該多肽是通過線粒體介導通路誘導腫瘤細胞凋亡[17]。Cheng Linyou等[18]從Ciona intestinalis L.海鞘中提取得到的一種小分子水溶性化合物CI431，對腫瘤細胞有極強的抑制活性，對于A549、HeLa細胞的半數抑制濃度分別為39.472 μg/mL和30.417 μg/mL。羅寧等[19]研究了皺瘤海鞘乙醇提取物對腫瘤細胞的抑制作用，對于MCF-7以及HuH-7細胞的半數抑制濃度分別為1 695.785 μg/mL和1 763.665 μg/mL。在前人的研究基礎上，本研究選取南海海鞘優勢物種皺瘤海鞘為研究對象，分別探討其被囊及內臟團兩部分對于A549細胞的生長抑制作用，并進一步將甲醇提取物按照極性分為9 個組分，最后篩選出對于A549細胞生長抑制作用最強的組分VCEF-6，其24 h半數抑制濃度僅為168.7 μg/mL。與發達國家相比，我國的海洋藥物研究起步較晚，而我國擁有300萬 km2的海洋國土面積，海洋生物資源豐富；因此，開展海洋天然活性產物的研究迫在眉睫。

研究表明從海鞘體內分離得到的活性產物大部分是來源于與其共附生的微生物[20]。Tianero等[21]在對32 種不同海鞘共附生微生物以及代謝產物的研究中發現，不同種類的海鞘的共附生微生物具有極大的多樣性，并且具有物種特異性以及地理位置特異性。其中，具有地理位置特異性的代謝產物主要包括一些脂類，而具有物種特異性的代謝產物主要囊括了多種次級代謝產物。本研究中提取得到的皺瘤海鞘抗腫瘤組分VCEF-6是由海鞘本體產生還是共附生微生物產生，有待于進一步研究。

細胞凋亡是細胞為了維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序的死亡。與細胞凋亡不同，細胞壞死為被動過程，而凋亡是主動過程。大量研究表明，細胞凋亡與腫瘤等許多疾病的發生密切相關，目前，許多抗腫瘤藥物作用的主要機制之一是誘導腫瘤細胞凋亡[22-24]。在細胞凋亡研究中，流式細胞術是一種定量的技術手段，能夠較為精確地測定出凋亡細胞占所測定總細胞的比例。錢葉等[25]利用流式細胞術研究了松乳菇多糖對腫瘤細胞凋亡的影響，結果表明在質量濃度為12.5～50.0 μg/mL范圍內，松乳菇多糖顯著誘導A549細胞的凋亡，并呈現出劑量依賴關系。趙敬等[26]使用流式細胞儀研究了姜黃素對HeLa細胞凋亡的調控作用，發現隨著姜黃素質量濃度的增大，大量的HeLa細胞被阻滯在S期，表明姜黃素可能是通過將細胞阻滯在S期，使其不能進入下一增殖周期來抑制腫瘤細胞的生長。本實驗采用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒經流式細胞儀檢測VCEF-6誘導A549細胞的凋亡情況，結果顯示，與空白組相比，不同質量濃度VCEF-6處理組的A549細胞均出現一定程度的凋亡，且隨著VCEF-6質量濃度的增加，凋亡率明顯升高。這說明VCEF-6對A549細胞的凋亡具有明顯的誘導作用，且呈劑量-效應關系。

本研究在篩選出對A549細胞抑制活性最強的皺瘤海鞘醇提物組分（VCEF-6）的基礎上，采用GC-MS法分析該組分的化學成分，從中鑒別出22 種化學成分，包括甾醇類6 種、烷烴類6 種、脂肪酸酯類6 種、芳香族化合物4 種。參考相關文獻，發現VCEF-6的化學成分中已報道的具有抗腫瘤活性的化合物為豆甾醇[27-28]和麥角甾醇[29]，因此，推測甾醇類組分為VCEF-6發揮抗腫瘤活性的重要物質基礎。此外，VCEF-6能夠發揮抑制腫瘤細胞生長的活性，其機制可能與中藥及其方劑多組分、多靶點的整合作用相似。中藥由活性物質群構成，并且按照一定比例組合，活性物質群通過多靶點、多途徑經整合發揮作用[30]。VCEF-6的多組分是如何發揮腫瘤細胞生長抑制作用以及作用于哪些靶點，有待進一步研究。

4 結 論

本實驗以甲醇為溶劑提取得到皺瘤海鞘被囊及內臟團的醇提物，并用MTT法檢測不同質量濃度醇提物對A549細胞的生長抑制作用，結果表明在較低質量濃度（25～75 μg/mL）下，被囊及內臟團醇提物對A549細胞生長沒有抑制作用，當質量濃度增大到100 μg/mL以上時，其對于A549細胞表現出明顯抑制作用。采用硅膠柱層析的方法將皺瘤海鞘醇提物根據極性分離純化為9 個不同組分，并分別檢測其抗腫瘤活性，發現有8 個組分對A549細胞具有明顯的生長抑制作用，其中活性最強的組分為VCEF-6，對于A549細胞的半數抑制濃度為168.7 μg/mL。進一步利用流式細胞術以及熒光顯微鏡觀察表明，VCEF-6強烈抑制腫瘤細胞生長與其能夠誘導細胞凋亡有關。最后，使用GC-MS技術分析VCEF-6的化學成分，利用計算機譜庫檢索結合人工分析鑒定出22 種化合物，其中含量較高的有膽甾醇（34.46%）、麥角甾-5,22-二烯-3-醇（3.82%）、鏈甾醇（2.00%）、豆甾-5,24（28）-二烯-3-醇（1.98%）、穿貝海綿甾醇（1.94%）、十六酸甲酯（1.90%）、豆甾醇（1.44%）、硬脂酸甲酯（1.43%）。