甜瓜離體雌核發育誘導單倍體研究進展

柯思佳 錢春桃 包衛紅 倪維晨 李瑞霞

摘 要：自然界中自發的單倍體發生概率極低，通過人工的單倍體誘導技術能夠大大提高單倍體發生概率。離體雌核發育誘導單倍體是植物單倍體育種的重要手段之一，重點綜述了近年來通過離體雌核發育途徑誘導甜瓜單倍體的研究進展，包括未授粉子房離體培養途徑和輻射花粉誘導單倍體培養途徑，分別討論了供體基因型、培養基、接種時胚珠的發育時期、預處理方式等因素對誘導甜瓜單倍體再生頻率的影響，同時對甜瓜單倍體培養中存在的問題進行了分析和討論，并對甜瓜單倍體培養的前景進行了展望，以期為接下來甜瓜離體雌核發育誘導單倍體的研究工作提供參考。

關鍵詞： 甜瓜； 雌核發育； 單倍體培養； 影響因素

Abstract： The natural spontaneous occurrences frequency of haploid is very low，but it can be significantly increased through artificial haploid induction techniques. In vitro gynogenesis is one of the most important approaches of plant haploid production. The paper reviewed the research progress on producing melon haploid by in vitro gynogenesis，including in vitro culture of unpollinated ovule and haploid induction via irradiated pollen. The effects of factors such as material genotype，medium，the stage of ovule development，pretreatment on haploid regeneration in melon were discussed. Meanwhile，the problems existing in melon haploid culture were analyzed，and the prospects of melon haploid culture were provided for in vitro gynogenesis in melon.

Key words： Melon； In vitro gynogenesis； Haploid culture； Influencing factors

甜瓜（Cucumis melo L.）屬葫蘆科甜瓜屬一年生草本植物，是栽培作物中變異類型最多的作物之一。我國是甜瓜栽培的次生起源中心之一，積累了豐富的甜瓜種質資源，現有1 132份，為甜瓜育種工作提供了充足的試材[1-2]。然而，由于常規育種中甜瓜自交系的選育周期長、工作量大，育種進程受到極大限制。如果我們能夠縮短優良自交系的選育周期，就可以提高甜瓜雜種一代的育種速度[3]。自1922年Blakeslee[4]首次報道單倍體技術以來，植物遺傳學家、植物生理學家、植物遺傳育種學家等立即投入了對單倍體的研究。經試驗證明，單倍體在植物遺傳研究和育種實踐中均具有重要的價值[5-7]。經過離體雌核誘導單倍體技術，再經染色體加倍能迅速獲得純合的雙單倍體植株。利用這項技術，便可大大加速育種進度，獲得新的育種材料，并且節省人工人力。因此，對于單倍體離體雌核發育途徑的研究具有重要的意義。

1 未授粉子房離體培養

自San Noeum[8-9]首次在對大麥未授粉的子房培養中得到了單倍體植株以來，學者們開始在小麥[10]、玉米[11]以及西瓜[12]等不同作物上進行未授粉子房的離體培養，未授粉子房離體培養技術開始成為產生單倍體的一個重要途徑。在葫蘆科作物未授粉子房離體培養的研究中，已經在黃瓜[13]、甜瓜[3]、西瓜[12]等植物中獲得了單倍體植株。一般通過未授粉子房離體培養，結果通常會產生單倍體（H）、雙單倍體及多倍體與非整倍體植株，這幾類植株無論是在植物遺傳學研究還是在育種實踐中都有很高的利用價值[14]。

在20世紀90年代，Gemesne等[15]及Ficcadenti等[16]率先對甜瓜未授粉子房離體培養技術進行摸索，并成功獲得了甜瓜單倍體植株。21世紀以后，我國才開始了對甜瓜未授粉離體培養的研究。2004年，韓麗華[17]報道了通過甜瓜未授粉胚珠離體培養成功獲得單倍體植株。隨后王林[3]也開始了甜瓜未授粉胚珠離體培養的研究，但試驗最終僅獲得了叢生芽，分化的叢生芽倍性也有待進一步鑒定。2012年牛明明[18]以8個甜瓜雜交種為試驗材料進行了離體雌核發育誘導單倍體的試驗，但未能誘導出再生植株。

2 輻射花粉授粉誘導雌核發育

1987年，Sauton[19]等首次進行了甜瓜輻射花粉授粉誘導雌核發育的研究并成功獲得了甜瓜單倍體植株。2002年，查丁石[20]在日本以X射線輻射花粉誘導雌核發育誘導形成了單倍體胚。隨后，張永兵等[21]、孫玉宏等[22]、薛皓等[23]分別對甜瓜的基因型、培養基、輻射劑量、單倍體植株的加倍等方面進行了摸索，并對單倍體甜瓜的加倍進行了研究，為接下來我國研究者對甜瓜離體繁殖的研究打下了基礎。

3 影響離體雌核發育途徑的因素

3.1 基因型

經國內外許多學者研究發現，離體雌核發育誘導單倍體的成敗及誘導率的高低與基因型有很重要的關系。不同基因型的材料其誘導率和出胚率有極顯著差異，并且在同等誘導條件下，特定的基因型只對特定的培養基有反應[24]。Ficcadenti等[25]發現甜瓜不同的正反交組合對單倍體誘導率的影響差異顯著。韓麗華[17]曾誘導了少數不同甜瓜品種未授粉胚珠，但只有厚皮甜瓜品系‘2B39誘導出單倍體植株。王林[3]發現甜瓜基因型除了影響離體培養的誘導效果之外，對其誘導途徑也有影響。牛明明[18]以8個甜瓜雜交種為試驗材料，發現不同基因型的甜瓜啟動雌核發育的反應率明顯不同。同樣在甜瓜輻射花粉誘導雌核發育的試驗中，基因型也是一個很關鍵的因素[26]。薛皓等[23]以48個甜瓜基因型為材料，結果有18個基因型沒有誘導出再生植株。張永兵等[21]以5種甜瓜基因型為試材，結果只有其中2種獲得了單倍體植株。牛明明[18]以2個雜交一代‘M1和‘M6為試驗材料進行輻射花粉誘導單倍體試驗，最終只有雜交種‘M1獲得再生苗。由此可見，基因型對于雌核發育誘導單倍體技術有很重要的影響。所以我們在建立通過雌核發育誘導甜瓜單倍體的再生體系的時候，應該擴大對基因型的選擇，并且針對每種基因型篩選出其特定的誘導條件，以提高單倍體的誘導率。

3.2 培養基組成

在未授粉子房離體培養試驗中，培養基為外植體的生長發育提供了所需的營養物資，是人工誘導形態建成和離體雌核發育的重要影響因素。培養基對子房培養的影響是多方面的，包括對基本培養基類型的選擇、外源激素種類及濃度等。這些因素之間相互影響，存在一定的交互作用，任何一個因素的改變都可能改變培養基的理化性質，從而改變試驗效果。在實際工作中，不同的基因型都有其最適合的培養基，并且某些基因型只有在特定的培養基中才能被成功誘導，這給研究者們的工作增加了很多困難。

基本培養基對單倍體培養的影響很大，目前常見的基本培養基有MS、N6、CBM、White等，或在此基礎上對某些成分略加改良。在葫蘆科作物中，一般MS培養基相對比較適用。此外，外植體在培養過程中通常需要添加一些外源激素才能更好地誘導愈傷組織、胚狀體的形成及芽、根的分化。韓麗華[17]用Zip、BA和IBA等激素成功誘導出了厚皮甜瓜的胚狀體植株。Malik等[27]發現在甜瓜誘導培養基中添加0.04 mg·L-1和0.02 mg·L-1的TDZ能明顯增加胚珠愈傷的產生，而0.6 mg·L-1的6-BA激素能明顯增加外植體再生率。王林[3]在改良后的MS培養基上加入不同濃度的TDZ，結果發現，不同濃度TDZ預培養的胚珠膨大情況隨著誘導培養基的不同而不同。牛明明[18]則發現啟動雌核發育的最佳熱激預處理培養基為：MS+0.04 mg·L-1 TDZ，最佳胚狀體誘導培養基為MS+6 mg·L-1 2，4-D+2 mg·L-1 6-BA。通常培養基中也會添加少量附加成分，如AgNO3。Mohiuddin等[28]認為，AgNO3通過影響愈傷組織的內源激素代謝水平從而影響著葫蘆科植物植株的再生。韓麗華[17]用不同濃度的AgNO3對甜瓜胚珠進行處理，發現用80 mg·L-1的AgNO3處理時出胚率最高，為0.74%。此外，除了添加外源激素外，培養基里還應該添加碳源，碳源不僅能給外植體提供能量，而且能維持一定的滲透壓[29]。一般來說，蔗糖是最常用的碳源。有研究表明在葫蘆科作物中，碳源濃度在20～40 g·L-1時誘導率較高，并且易于誘導形成單倍體植株[30]。在甜瓜的誘導中蔗糖濃度一般為30 g·L-1[3，17-18]。

在輻射花粉授粉進行胚拯救時，胚狀體就已經形成，因此在試驗中對基礎培養基的要求沒有未授粉子房、胚珠培養那么嚴格，一般選擇E20A或MS培養基[18]。張永兵等[21]將長出綠色胚胎的種子，剝除種皮后轉接到MS+0.2 mg·L-1 6-BA培養基上繼續生長，最終誘導出2株單倍體再生植株。孫玉宏等[22]將長出綠色胚胎的種子剝取綠胚后，接種在MS+0.2 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1活性炭的培養基上生長，誘導29棵植株成苗，其中有11棵為單倍體植株。牛明明[18]和薛皓等[23]則通過試驗發現在輻射花粉授粉進行胚拯救的基本培養基上即使不添加任何外源激素也可以誘導出單倍體植株。

3.3 接種時胚珠的發育時期

眾多研究結果表明，接種時胚珠的發育時期對于未授粉子房離體培養試驗中胚狀體的誘導是一個很重要的因素。大量試驗表明，接近成熟或成熟胚囊時期的子房或胚珠對于誘導雌核發育比較容易成功，而過于幼嫩的子房[31]或者大孢子時期[32]的子房誘導比較困難。韓麗華[17]、王林[3]等都認為對開花前14 h的甜瓜未授粉子房進行誘導，效果最好。牛明明[18]在開花前2 d、開花前1 d以及開花當天分別選取甜瓜未授粉子房進行誘導，結果發現，不同發育時期的子房誘導效果差異顯著，開花前1 d的子房培養效果最好，開花前2 d的次之，開花當天的最差。

3.4 預處理

在接種前通常要對材料進行黑暗、變溫等預處理，通過改變細胞的生理狀態、分裂方式及發育途徑，從而提高雌核發育的誘導率。在葫蘆科作物中，一般對材料進行4 ℃的低溫預處理。Metwally等[33]認為甜瓜在4 ℃低溫下處理36 h誘導效果較好。Malik等[27]認為4 ℃低溫培養4 d可以有效提高甜瓜出胚率。但是在我國，更多的是對甜瓜進行不同時間的熱激處理。韓麗華[17]、王林[3]等認為甜瓜最佳培養條件為35 ℃暗培養4 d。牛明明[18]通過研究發現，30 ℃黑暗條件下熱激3 d雌核發育的誘導率最高。

3.5 輻射源及輻射劑量

在輻射花粉授粉誘導單倍體試驗中，輻射源及輻射劑量的選擇是成功的關鍵。它受作物種類、植物生長期、輻射器官等多種因素的影響，適宜輻射劑量的選擇是一個長期的過程，但研究者們已經摸索到一定的規律。實踐中大多以臨界劑量或半致死劑量作為適宜劑量的標準，在未到達臨界致死劑量以前，單倍體的誘導頻率隨劑量的升高而增加。此外，輻射劑量與植物的倍性及花粉粒的大小也有關，倍性越高，花粉粒越小，越耐輻射。Faris等[34]認為Co60所產生的γ射線是葫蘆科作物輻射花粉授粉誘導單倍體的有效輻射源。甜瓜的輻射劑量較常用的是500～2 500 Gy[19]。張永兵等[21]在300 Gy時成功誘導出了單倍體植株，而劑量為600 Gy時未能誘導供試材料形成單倍體。而牛明明[18]卻得到了相反的結論。孫玉宏等[22]發現在300、500、750和1 000 Gy幾個劑量中，以750 Gy劑量輻射處理的效果最好。薛皓等[23]則發現800 Gy的輻射劑量能使甜瓜的坐果率和再生植株的誘導率都達到相對較高的水平。所以在試驗中在實際操作中，我們需要針對不同基因型的甜瓜做不同的輻射處理，從而確定適宜的輻射劑量，不能一概而論。除了Co60所產生的γ射線外，也有一些學者用X射線輻射花粉，如Yashiro等[35]利用X射線（67.08 C·kg-1）輻射花粉，在5個甜瓜基因型上成功誘導出單倍體胚。查丁石[20]也利用650 Gy的軟X射線照射獲得了甜瓜單倍體植株。

3.6 花粉輻射

據研究表明，植物生長過程中，適宜的溫、濕度可以得到高單倍體發生率。針對葫蘆科作物，通常在開花前1 d對雄花進行輻射處理后保存在低溫（4 ℃）干燥條件下，第2天再給母株授粉。一般來說，高的輻射劑量可以提高胚的誘導率。但是在到達雌核發育臨界致死劑量之前，低溫貯存的時間越長，經高劑量輻射過的花粉活力喪失越快，而且可產生較高的花粉萌發率，這樣反而會降低單倍體植株的發生率。所以在實際操作過程中，盡量在雄花進行輻射處理后立即授粉，從而提高單倍體的誘導率。而且在授粉過程中，每朵雌花需用3～4朵輻射過的雄花授粉，這樣不僅可以增加花粉管到達胚囊的數量，而且可以更加有效地促進雌核發育[19，36]。

3.7 胚拯救

在輻射花粉誘導雌核發育過程中，種子中敗育胚的比例很高，所以必須及時進行胚拯救。過早或過晚地進行胚拯救都會大大影響胚拯救的效果。Sauton[19，37]等通過試驗發現甜瓜幼胚授粉后3周后在MS+0.2 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1活性炭的培養基上進行胚拯救，可以提高單倍體胚的誘導效率。薛皓[23]在授粉后3～4周采收果實進行胚拯救，誘導出正常發育的胚。張永兵等[21]和牛明明[18]在授粉4～5周進行胚拯救，結果都得到了單倍體植株。以上試驗表明，甜瓜輻射授粉后3～5周做進行胚拯救，可以大大提高單倍體胚的誘導效率，此時多數胚為心形胚時可以獲得高單倍體誘導率。但是孫玉宏等[22]通過試驗發現，授粉后12 d為甜瓜胚拯救的最佳時間。這可能是因為特異的甜瓜基因型其胚敗育的進程不一樣，需要針對具體基因型具體分析。Custers等[38]通過研究發現，幼胚發育到心形胚階段在適宜的培養基（E20A培養基含0.01 mg·L-1 IAA）上進行胚拯救，可以大大提高單倍體胚的誘導率。而且Kurtar等[39]通過倍性鑒定，僅有53.8%魚雷形胚和23.1%的心形胚發育成單倍體，其余的則發育成雙單倍體。

3.8 其他因素

除了上述因素，植物的生理狀態及接種方式等因素都會對甜瓜離體雌核發育產生影響。

植物的生理狀態受栽培的季節及所處的生長環境決定，對于離體雌核發育的誘導率和出胚率有一定的影響。趙曉菲[40]在對不同栽培季節的西葫蘆子房進行誘導時發現，胚狀體誘導率存在著極顯著性差異，其中秋季最高，其次是夏季，春季最低。王林[3]發現，在相同的培養條件下春季的胚珠污染率明顯高于秋季。然而韓麗華[17]在5月下旬進行甜瓜單倍體培養得到了單倍體植株，但是8月份同樣的方法卻未得到。

子房或胚珠不同的消毒方式和切割方式也影響著胚狀體的誘導頻率。陳玲[41]、閔子揚[42]等認為先切片再消毒比先消毒再切片更有利于未授粉子房進行離體雌核誘導。陳玲[41]和陳學軍等[43]認為在子房橫切、縱切、切啄、完整胚珠4種切割方式中，橫切最有利于離體雌核發育的誘導。并且在培養基上，外植體的擺放也是有依據的，它會因為外植體的切分方式不同而不同，也會因為作物種類的不同而異。在黃瓜雌核發育誘導單倍體的試驗中，Gemesne等[15]采用分離出胎座條平放在培養基上的方式進行接種，蘇芃[44]則是切取1 mm厚的子房薄片平放在培養基上。孫松松[45]在對西葫蘆未授粉子房離體培養的試驗中，先去掉子房的外表皮，再切為1～1.5 mm的薄片平放在培養基上進行預培養。謝冰等[46]則是從未授粉的西葫蘆子房中剝取完全的胚珠接種在培養基上，這種方式更有利于胚珠吸收營養，誘導效果更好，觀察起來也更方便。韓麗華[17]在甜瓜未受精胚珠離體培養的研究中，通過比較剝胚珠法分離出胎座和橫切為0.3～0.5 mm的薄片這2種接種方式后發現，經切片培養的胚珠，胎座組織對胚珠的生長有抑制作用，導致胚珠競爭不到營養，珠被發生愈傷化。

4 甜瓜單倍體培養存在的問題與未來研究的重點

雖然通過離體雌核發育途徑獲得甜瓜單倍體技術已經取得了一定的進展，但是在實際培養過程中還是存在著很多問題。胚狀體的誘導率、成苗率很低，重復性差，至今未能建立起一套重現性好的培養體系，這些都嚴重影響著試驗進程。而這主要是因為以下幾點：一、基因型依賴性強。二、培養過程受多種因素相互影響。三、愈傷組織誘導率及分化率低。在今后的研究中，如何優化試驗技術，提高誘導率從而建立穩定可重復的甜瓜單倍體培養體系依然是研究的重點。

目前在玉米單倍體育種中，報道了一個名為MATRILINEAL（MTL）的玉米花粉特異性磷脂酶基因[47-48]。據研究表明，該基因突變后能誘導玉米單倍體的形成，且在其他作物中具有保守性。隨后，有研究發現水稻中的玉米MTL同源基因OSMATL經CRISPR-Cas9技術突變后可以誘導單倍體種子的形成[49]。所以在今后對甜瓜單倍體的研究中，應該在甜瓜中找到類似的同源基因來誘導甜瓜單倍體的形成，解決目前甜瓜單倍體育種中基因依賴性強的一大難題。

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