禾谷類白粉菌無毒基因研究進展

喻大昭 曾凡松

摘要

基因對基因假說闡明了病原菌無毒基因（avirulence gene， Avr gene）與寄主植物抗性基因（resistance gene， R gene）相互識別和互作的關系。禾谷類白粉菌無毒基因產物作為重要的激發子，能夠與其寄主R基因產物發生特異性互作，誘導植物細胞防衛反應。為了更加深入地了解這些無毒基因的作用，作者總結了最近關于AVRa1、AVRa10、AVRa13、AVRk1、AvrPm2和AvrPm3a2/f2等已克隆無毒基因的研究進展，討論了它們作為效應蛋白（effector）或激發子的雙重功能，在毒性菌株中的變異規律，與其對應R基因之間的互作模型，以及與轉座子等重復序列之間的關聯等。本文還對無毒基因研究方法的改進和未來的研究方向提出了建議。

關鍵詞

無毒基因; 禾谷類白粉菌

中圖分類號：

S 435.12

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018290

Avirulence genes in cereal powdery mildews

YU Dazhao， ZENG Fansong

（Key Laboratory for Integrated Management of Crop Pests in Central China， Ministry of Agriculture of

China， Hubei Key Laboratory for Control of Crop Diseases， Insect Pests and Weeds， Institute of

Plant Protection and Soil Science， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract

The gene-for-gene hypothesis elucidates the recognition and interaction between avirulence gene （Avr gene） of pathogens and resistance gene （R gene） of hosts. Avr protein of the cereal powdery mildew pathogens， as important elicitors inducing defense reaction in plant cells， can interact specifically with the cognate R proteins of their hosts. To further understand the roles played by these Avr genes， we summarized the recent progress in Avr genes like AVRa1， AVRa10， AVRa13， AVRk1， AvrPm2 and AvrPm3a2/f2. The dual function of these avirulence genes acting as effectors or elicitors， their variation in virulent isolates， the interaction models between them and their cognate R genes， as well as their association with repetitive sequences such as transposons were discussed. Better methodologies used for Avr gene studies and future research focus were also suggested.

Key words

avirulence gene; cereal powdery mildews

在符合基因對基因學說的植物病害中，植物的抗性基因（resistance gene， R gene）與病原菌的無毒基因（avirulence gene， Avr gene）相互識別，激發植物抗病性[1-2]。大多數R基因編碼保守的NLR（nucleotide-binding， leucine-rich repeat receptor， NLR）受體類蛋白[3]。R蛋白直接或間接地與其對應的無毒基因產物識別，激發植物細胞過敏性壞死反應（hypersensitive reaction， HR）[4]。一方面，在R蛋白施加的選擇壓力作用下，病原菌通過效應子（effector）的進化來逃避R蛋白的識別，從而阻止寄主產生防衛反應[5]。另一方面，由于R蛋白識別的特異性主要是受其富含亮氨酸重復（leucine-rich repeat，LRR）結構域控制的，植物可以通過LRR結構域中少數幾個氨基酸的突變對抗性進行修飾[6]。因此，植物R蛋白與病原菌Avr蛋白之間存在著協同進化關系。由禾布氏白粉菌Blumeria graminis引起的禾谷類白粉病是大麥和小麥等作物上的重要病害，且白粉菌與其寄主之間存在基因對基因關系[7-8]。白粉菌無毒基因的克隆和功能分析不僅有助于從分子層面上理解病原菌毒性變異和與寄主協同進化的機制，而且有助于建立病原菌致病型快速檢測技術，監測病原菌的毒性變異，以便合理有效地利用抗性資源。因此，作者對禾谷類白粉菌無毒基因的來源、克隆、特征、功能、變異及其研究方法等方面進行了歸納和總結。

1 禾谷類白粉菌效應子基因

病原菌通過向植物細胞中注入一類被稱為效應子的分泌性毒性因子來抑制植物先天免疫反應[9]。在這些效應子基因中，一些能夠被植物特定的R蛋白識別的基因被稱為無毒基因[10]。因此，效應子基因的鑒定可以為無毒基因的克隆提供候選基因。大麥白粉菌B.graminis f.sp. hordei（Bgh）基因組分析結果表明，Bgh含有491個N端帶有信號肽的候選分泌性效應子蛋白（candidate secreted effector protein， CSEP）[11-12]。在小麥白粉菌B.graminis f.sp.tritici（Bgt）的基因組中鑒定出了437個CSEP編碼基因和165個不含有信號肽的效應子基因。

而且，大部分Bgh效應子基因（79%）和Bgt效應子基因（99%）在吸器中表達，暗示它們可能在禾谷類白粉菌與寄主互作和致病過程中發揮作用[11， 13]。序列特征分析表明，白粉菌的這些效應子基因通常編碼比較小的蛋白，在序列上與其他真菌的基因沒有同源性，它們彼此具有明顯的序列分化[12]，說明它們可能靶向寄主細胞中不同的蛋白，執行不同的功能。但是，大多數CSEP的N端信號肽下游含有一個保守的YFWxC基序[14]。該基序的保守性提示它們可能與卵菌效應子保守RxLR基序類似，在效應子蛋白分泌進入植物細胞過程中起作用[15]。另外，與其他非CSEP基因相比，CSEP基因具有更高的氨基酸替換dN/dS比值，這說明效應子基因存在明顯的多樣化選擇趨勢，在與寄主協同進化過程中具有更快的進化速率[13， 16-17]。

2 禾谷類白粉菌無毒基因的特征和功能

到目前為止，在禾谷類白粉菌無毒基因中，只有少數幾個被克隆。從20世紀90年代開始，一些植病工作者對Bgh的無毒基因進行了遺傳分析。對菌株雜交后代的分析結果表明，AVRa6和AVRa7的無毒性均由兩個位點控制[18-20]。最近的研究表明，小麥白粉菌無毒基因AvrPm3位點的情況更加復雜。對菌株96224與菌株94202的雜交后代表型分析發現，AvrPm3b和AvrPm3d的無毒位點由3個無毒位點控制[21-22]。這些結果說明多個基因參與了白粉菌與寄主之間的識別和互作。

AVRk1和AVRa10是最早從禾谷類白粉菌中克隆的無毒基因，這兩個基因屬于一個含有1 350個旁系同源物的大家族，EKA（effector homologous to AVRk1 and AVRa10）基因家族。功能分析證明，它們能夠分別與大麥的Mlk1、Mla10互作，激發寄主防衛反應。相反，這兩個基因在感病品種中表達時，則會促進病原菌的侵入[7]。這些結果反映出白粉菌無毒基因的雙重功能，即在非親和互作中的激發寄主免疫反應功能和在親和互作中壓制寄主防衛反應的功能。最近，從Bgh中克隆了兩個無毒基因AVRa1和AVRa13，雖然它們在序列上沒有相關性，但都能分別被大麥等位基因Mla1和Mla13識別，說明病原菌已經進化出用序列上完全不相關的無毒基因與序列上相似的R基因識別的互作模式[23]。

從Bgt中克隆的第一個無毒基因是對應于小麥R基因Pm3a和Pm3f的AvrPm3a2/f2[21]。這個基因是一個典型的CSEP編碼基因。具有該基因的菌株能夠被Pm3a和Pm3f識別。除了這個基因參與了對無毒性的控制之外，還存在著一個抑制基因（suppressor，Svr）對AvrPm3a2/f2起調控作用。當Svr基因起作用時，AvrPm3a2/f2表達水平不足以滿足其與R基因識別，因此也不足以激發寄主防衛反應。相反，當Svr基因突變為沒有功能的svr基因時，足量的AvrPm3a2/f2才能完成與R基因的互作，誘導寄主抗病反應。這種模式使得病原菌在不改變無毒基因序列的情況下，也能夠通過另外一個基因在轉錄水平上的調控，逃避其與R基因的識別，從而增強了病原菌的適應性[8]。而且，這一互作模型證明多個基因參與了AvrPm3與Pm3的互作，不僅豐富了基因對基因學說的內容，而且說明了病原菌無毒基因與寄主R基因互作的復雜性。

最近，我們與瑞士蘇黎世大學Beat Keller教授的研究團隊合作，從Bgt中克隆了另一個無毒基因AvrPm2。它編碼的蛋白N端含有21個氨基酸的信號肽，其信號肽下游具有保守的YFWxC基序，同時還含有卵菌的RxLR基序，具有典型CSEP的特征，能夠與Pm2識別并激發寄主細胞HR反應[24]。AvrPm2在結構上與已知的RNase類核糖核酸酶具有同源性，如大麥白粉菌BEC1011（Bgh effector candidate）和BEC1054。BEC1011參與抑制寄主細胞HR反應[25]，BEC1054則能夠與多個大麥蛋白互作，且對于吸器的形成是必需的。這兩個效應子都參與了Bgh對大麥的致病過程[26]。這些結果說明AvrPm2可能也具有像AVRa10和AVRk1那樣的雙重功能。而且，RNase類核糖核酸酶可能是禾谷類白粉菌無毒基因的另一大來源。

3 禾谷類白粉菌無毒基因的變異

在寄主R基因施加的選擇壓力下，病原菌會通過無毒基因的變異產生對含有相應的R基因植株表現親和的菌株。從目前已知的白粉菌無毒基因中，我們發現在無毒菌株與毒性菌株之間至少存在4種變異類型：單個氨基酸突變、連續氨基酸突變、插入突變和基因缺失。Bgt對Pm2的表型改變是由于AvrPm2所在基因組區域的12 kb的大片段缺失造成的。大片段的缺失可能是與旁側copia轉座子的同源重組事件有關。而且，在禾谷類白粉菌的另外兩種專化型，黑麥白粉菌B.graminis f.sp. secalis和小黑麥白粉菌B.graminis f.sp. triticale中，保守的AvrPm2等位基因也存在類似12 kb的缺失[24]。這反映出無毒基因與其寄主R基因的協同進化關系。比較無毒菌株與毒性菌株的AVRk1序列發現三種變異：1）點突變導致蛋白提前終止;2）核苷酸插入導致移碼突變;3）連續多個氨基酸的突變。AVRa10的序列變異包括單個氨基酸的改變和單個堿基插入導致的移碼突變[7]。小麥白粉菌AvrPm3a2/f2在毒性菌株中由于兩個氨基酸的差異而不能被Pm3a和Pm3f識別[21，27]。Bgh的AVRa1的點突變還有能夠導致無毒基因功能喪失的例子[23]。另外，Bgh對Mla13親和的毒性菌株要么通過無毒基因AVRa13提前終止，要么通過基因3′端一段連續的氨基酸突變來獲得毒性[23]。以上這些變異類型在其他真菌無毒基因中均有報道。例如，油菜莖基潰瘍病菌Leptosphaeria maculans的AvrLm1以及稻瘟病Magnaporthe oryzae的AVR-Pia、AVR-Pii和AVR-Pik/km/kp[28-29]。稻瘟菌對Pib的毒性不僅可以通過AvrPib的點突變、基因缺失（或片段缺失）來獲得，而且可以通過轉座子的插入來實現[30]。盡管白粉菌無毒基因的變異與轉座子等重復序列密切相關，但目前還沒有在白粉菌中發現由于轉座子插入帶來的毒性變異。除上面提到的AvrPm2之外，Bgh無毒基因AVRa10和AVRk1所在基因家族的成員均與I型長散布核原件（long interspersed nuclear elements， LINE-1）反轉座子家族（TE1a）共進化，新的變異類型可能從大量的與AVRa10和AVRk1同源的基因中進化而來[31]。

4 禾谷類白粉菌無毒基因的克隆方法

截至目前，在禾谷類白粉菌中已經發現的無毒基因（位點）中，絕大多數是通過圖位克隆的方法鑒定的[8]。這種經典的遺傳學方法在沒有基因組序列的時代發揮了重要作用。但是，在沒有參考基因組的情況下，由于重復序列的存在，通過在很寬的連鎖標記區域進行染色體步移來獲得無毒基因并不是十分高效。禾谷類白粉菌基因組序列的公布[11，13]為白粉菌基因的克隆和功能解析提供了非常實用的工具，顯著提高了白粉菌無毒基因克隆的速度。AvrPm3a2/f2是第一個被克隆的小麥白粉菌無毒基因，該基因的克隆采用了二代測序技術和高通量基因型鑒定技術相結合的策略，大大提高了圖位克隆的效率[21]。近年來，由于測序通量的提高和成本的降低，為組學分析技術在無毒基因鑒定中的應用帶來了更大的空間。Praz等利用來自不同地區60個菌株的基因組序列，進行了全基因組關聯分析，成功克隆了AvrPm2[24]。這一套數據可以用于多個無毒基因的篩選和克隆，避免了重復構建雜交群體的工作。最近的AVRa1和AVRa13候選基因的克隆也采用了基于測序獲得的SNP關聯分析法，不同的是，SNP數據是來自對侵染葉片轉錄組的測序[23]。考慮到大多數效應子基因在吸器中表達，這種策略有效地縮小了篩選范圍，而且減少了其他基因和不表達的效應子基因的干擾。然而，白粉菌基因組含有大量的重復序列，這些序列的存在給無毒基因的克隆帶來困難[11，32]。在未來的研究中，利用自然群體和雜交群體的多組學數據，直接靶向編碼基因的分析策略將使得無毒基因的克隆變得更加高效。

5 展望

雖然禾谷類白粉菌無毒基因的研究在最近幾年取得了顯著的進展，但還有很多方面需要進一步闡明。LINE-1類無毒基因AVRa10和AVRk1具有與轉座子重復序列密切相關的序列特征[31]，這類無毒基因編碼產物是如何分別與Mla10、Mlk1互作，激發寄主防衛反應的？ AvrPm2編碼的Avr蛋白在序列上和結構上與RNase相似，且能夠激活Pm2介導的寄主細胞HR反應[24]，但仍然沒有明確兩者之間的互作是直接的還是間接的。這是因為AvrPm2與Bgh的AVRa13在序列上具有相似性，但是Pm2與Mla13在序列上卻沒有相似性。如果發生直接的互作，那么這些序列上沒有相關性且來源于不同寄主的R蛋白是如何被序列上相似的Avr蛋白識別的？ 可能的解釋是AvrPm2和AVRa13均能夠與寄主中1個保守的警衛蛋白（guardee）互作，且這個蛋白的變化能夠被Pm2和MLA13監視。那么這些蛋白是如何行使其功能的，與Pm2之間是如何識別的還有待研究。對AvrPm3a2/f2起調控作用的基因Svr編碼一個效應子，與已知的調控蛋白（例如轉錄因子或信號蛋白等）沒有序列相似性[21]，那么這個基因是如何調節AvrPm3a2/f2的表達量的？下一步采用生物化學方法對這些蛋白進行深入的研究將有助于加深從分子層面了解無毒基因與R基因之間的互作機制。另外，盡管可以利用基因槍轉化方法對基因進行瞬時表達驗證，但仍然費時耗力，建立高效穩定的白粉菌遺傳轉化技術體系將助力無毒基因的遺傳驗證。

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