核盤菌一分支酸變位酶同源效應蛋白的亞細胞定位

盛寅生 任愛芝 常雪 趙培寶

摘要

前期研究表明核盤菌Sclerotinia sclerotiorum產生的一種分支酸變位酶同源效應蛋白能夠提高其致病能力。為了進一步研究該效應蛋白在核盤菌致病過程中的作用機制，我們通過構建GFP融合蛋白對其分泌行為和亞細胞定位開展了研究。首先通過PCR技術擴增了該基因的啟動區+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）的DNA序列，構建GFP融合載體，然后借助REMI技術轉化核盤菌原生質體，篩選GFP能夠表達的轉化子，最后接種轉化子菌絲于煙草葉片，激光共聚焦檢測GFP熒光信號，發現GFP熒光與葉綠體自體熒光共定位，表明該效應蛋白可分泌進入寄主葉綠體內發揮作用。

關鍵詞

菌核病; 效應子; 啟動子; 信號肽; 葉綠體定位肽

中圖分類號：

S 432.44

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018025

Subcellular localization of an effector homologous with chorismate

mutase in Sclerotinia sclerotiorum

SHENG Yinsheng REN Aizhi CHANG Xue1，2， ZHAO Peibao1

（1. Department of Plant Protection， Liaocheng University， Liaocheng 252000， China;

2. Liaocheng Forestry Bureau， Shandong 252000， China）

Abstract

It has been proved that the effector homologous with chorismate mutase was related with pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum. In order to explore the pathogenicity mechanism of the effector， we analyzed the secretory and subcellular localization through constructing the GFP fusion protein. The DNA sequence of promoter +SP+CTP was cloned by PCR. Then the vector of GFP fusion promoter +SP+CTP was constructed， transformed in the protoplast of S.sclerotiorum using the REMI. The transformants in which GFP could express normally were obtained and the transformants mycelia were inoculated on the leaves of tobacco and the fluorescence signals were detected through confocal microscope. As a result， it was found that the GFP fusion protein could be secreted into host cell and colocalized with the chloroplast. The result indicated that the effector may play its role in the host chloroplasts.

Key words

sclerotinia rot; effector; promoter; signal peptide; chloroplast targeted peptide

核盤菌Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary屬子囊菌亞門Ascomycotina，核盤菌科Sclerotiniaceae，核盤菌屬Sclerotinia，是一種寄主范圍廣泛的植物致病真菌，能侵染油菜、向日葵、豆科、葫蘆科、茄科蔬菜等400多種植物，引起菌核病[1]。核盤菌與灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers.致病機制類似，屬于死體營養的病原真菌[2]。核盤菌對寄主的破壞性較大，在其致病過程中草酸和細胞壁降解酶發揮著重要作用[3-5]，而且核盤菌能夠產生活性氧并利用寄主過敏性壞死反應來克服寄主防御、促進自身侵染[6-8]。核盤菌全基因組序列的公布為核盤菌致病機制的研究開啟了新篇章，除了傳統的細胞壁降解酶、草酸等致病因子，人們也開始關注一些分泌性效應蛋白在核盤菌與植物互作過程中的作用。例如Guyon 等通過分泌組分析找到了78個潛在的效應蛋白候選對象，并對其中的16個分泌蛋白在不同植物中的表達模式進行了分析[9];Lyu等證明了小分子效應蛋白SsSSVP1能夠通過影響植物能量代謝來幫助自身侵染[10];Wang等研究發現核盤菌的效應蛋白Sspg1d能夠與植物體內的一個小分子蛋白IPG-1互作，在致病早期發揮作用[11];Zhu等發現分泌效應蛋白SSITL能于侵染早期階段在抑制茉莉酸介導的抗病過程中發揮作用[12]。我們前期研究明確了一分支酸變位酶同源效應蛋白能夠提高核盤菌致病性，但對其作用機制還不清楚。為了進一步探究其作用機制，我們對其亞細胞定位進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

核盤菌S.sclerotiorum由德克薩斯農工大學教授Dickman提供，保存于含PDA培養基的試管內;綠色熒光蛋白GFP基因來自質粒pBluntNAT-GFP1-1;潮霉素抗性基因hph來自質粒 PUC-ATPH;引物XS1-1：5′-GCAAGGAGGATCCTAATAGAATC-3′;XS1-2：5′-TCCCCCCGGGGCAT-GTTGTTCCATTAGGAAGG-3′為自行設計，用于擴增基因啟動區+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）部分，并于兩引物5′端分別增加了BamHⅠ和XmaⅠ酶切位點;根據潮霉素基因序列設計了篩選引物Hph1和Hph2，Hph1： 5′-ATGAAAAAGCCTGAACTC-3′;Hph2：5′-CTATTCCTTTGCCCTCGG-3′。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析

分別通過SignalP 4.1 Server、PredictNLS和ChloroP 1.1 Server等生物信息學工具對核盤菌的一分支酸變位酶同源效應子的信號肽、細胞定位特征進行分析。

1.2.2 基因片段的擴增及載體的構建

收集PDA培養的核盤菌菌絲，提取DNA，然后依據所設計的引物XS1-1和XS1-2擴增核盤菌分支酸變位酶同源基因的啟動區+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）的930 bp的DNA序列，將所得DNA片段與GFP基因融合構建轉化載體。方法為：以pBluntNAT-GFP1-1為基礎，插入真菌篩選標記潮霉素抗性基因，再將經PCR克隆獲得的含啟動子（N-Pro）+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）的DNA片段連入載體中，構建得到啟動子+SP+CTP+GFP融合載體pBluntNAT-PSC-GFP。

1.2.3 遺傳轉化及轉化子篩選

酶解法制備核盤菌原生質體，將融合載體通過REMI技術轉化核盤菌原生質體，300 μg/mL潮霉素篩選轉化子，并提取轉化子DNA，采用引物Hph1和Hph2進行 PCR，驗證潮霉素抗性基因在核盤菌基因組上的整合，最后通過熒光顯微鏡檢測GFP表達與否[13]。

1.2.4 效應蛋白的分泌特性及植物細胞定位分析

接種GFP能夠正常表達轉化子的菌絲于煙草葉片，通過熒光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號，分析其分泌特性和細胞定位。

2 結果與分析

2.1 信號肽及定位信號預測結果

通過SignalP 4.1 Server、PredictNLS 和ChloroP 1.1 Server等在線軟件對該效應蛋白進行分析，發現該蛋白具有20個氨基酸組成的信號肽（SP）序列，并且具有包含45個氨基酸的葉綠體定位肽（CTP）序列特征，二者的氨基酸殘基序列如圖1所示：

圖1 預測的效應蛋白信號肽和葉綠體

定位肽氨基酸序列

Fig.1 The SP and CTP of the effector

2.2 GFP融合載體的構建

2.2.1 啟動子+SP+CTP序列的擴增

采用引物對XS1-1/XS1-2進行PCR擴增，獲得長度約900 bp的DNA序列，如圖2所示。

圖2 效應子的啟動子、信號肽、葉綠體定位肽序列的

PCR產物電泳分析結果

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product

of the promoter+SP+CTP

經測序表明，該片段全長為938 bp，與預測的一致，包含分支酸變位酶基因740 bp的上游啟動區序列+信號肽序列+葉綠體定位肽序列，該DNA片段包含預測的啟動子元件CAAT Box和相應的信號肽、葉綠體定位肽序列，序列結果如圖3所示：

圖3 啟動子、信號肽和定位肽DNA序列

Fig.3 DNA sequence of the promoter+SP+CTP

2.2.2 GFP融合載體的構建

將潮霉素抗性基因hph插入pBluntNAT-GFP1-1中，再分別將經PCR克隆獲得的上述啟動子（N-Pro）+信號肽（SP）+葉綠體定位肽（CTP）的一DNA片段連入載體中，構建得到啟動子+SP+CTP+GFP融合載體，具體操作步驟如圖4所示。

2.3 轉化子的篩選與驗證

將上述載體經REMI介導的技術轉化核盤菌原生質體，篩選到了在含有300 μg/mL潮霉素的PDA培養基上生長的轉化子，提取轉化子DNA，以Hph1/Hph2為引物經PCR驗證，擴增到了預期條帶（圖5），表明轉化子中載體已整合到基因組中。

圖4 融合載體構建流程圖

Fig.4 Construction of the vector

圖5 PCR檢測轉化子中潮霉素抗性基因

Fig.5 Detection of hph gene in transformants by

PCR amplification

2.4 熒光蛋白細胞定位分析結果

將Natural Pro+SP+CTP+GFP融合載體轉化獲得的轉化子菌絲接種到煙草葉片上，經熒光顯微鏡檢測發現GFP熒光蛋白均能正常表達，并且發現熒光蛋白具有分泌到菌絲外的現象（圖6）。

圖6 融合GFP蛋白的表達及分泌性檢測

Fig.6 Expression and secretion of the fusion GFP protein

經轉化子接種的煙草葉片在56 h后進一步檢測葉片中熒光分布，同時制備煙草葉片原生質體，并通過熒光共聚焦顯微鏡檢測，發現GFP熒光和葉綠體自體熒光能夠共定位，GFP熒光蛋白有在細胞葉綠體內聚集現象（圖7～8）。

3 結論與討論

通過試驗我們得到了能夠正常表達GFP融合蛋白的轉化子，該融合蛋白包含核盤菌分支酸變位酶同源蛋白的信號肽和葉綠體定位肽。經過接種轉化子菌絲于煙草葉片后對熒光信號的檢測發現該融合蛋白能夠正常表達、具有分泌性并聚集于煙草葉片細胞中的葉綠體處。由此推測該分支酸變位酶同源蛋白發揮作用的部位可能是在葉綠體，可能通過影響光合產物中分支酸衍生物的合成，從而影響寄主防御反應。

圖7 GFP融合蛋白的熒光定位檢測結果

Fig.7 Subcellular localization of the fusion GFP protein

圖8 接種轉化子的煙草原生質體內融合GFP熒光檢測結果

Fig.8 Subcellular localization of the fusion GFP protein

分支酸衍生物 （chorismate derived compounds， CDCs） 在植物的生長、發育、防御及與其他生物的互作中起重要作用[14]，特別是水楊酸（SA）信號通路是植物體內重要的抗性相關信號通路[15]，在對活體寄生病原物的防御中發揮重要作用[16]。

莽草酸途徑（shikimate pathway）是微生物和植物的基本代謝途徑，其終產物是分支酸 （chorismate）[17]。分支酸是生物中許多化合物的前體， 包括芳香族氨基酸 （如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）、水楊酸 （SA）、IAA及其他次生代謝物[18]。

分支酸變位酶 （chorismate mutase， CM）催化分支酸轉化成預苯酸， 為苯丙氨酸與酪氨酸的合成提供前體，從而改變分支酸進一步轉化路徑，影響體內水楊酸的水平及其植物抗性水平[19]。對于寄生性的病原微生物來講，其所需要的苯丙氨酸和絡氨酸可以從寄主獲得，分支酸變位酶對于自身氨基酸代謝可能并不是必需的。但通過NCBI數據庫中BLAST發現該類基因在部分真菌如黑粉菌Ustilago maydis、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum等的部分病原微生物體內存在，推測可能在植物病原菌與植物的聯系中發揮作用。研究也證明了在專性寄生的黑粉菌中分支酸變位酶基因Cmu1與其致病性密切相關，植物感病后其水楊酸水平顯著下降[19]。生物信息學分析發現在死體營養的病原物中僅核盤菌具有分支酸變位酶同源基因，前期研究表明該基因與致病性相關，但對其如何發揮作用還不清楚。通常認為植物對死體營養病原物的抗性過程中水楊酸通路并不發揮主要作用[16]，因此對于該基因如何在核盤菌與寄主植物互作過程中發揮作用值得進一步深入探索。

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（責任編輯： 楊明麗）