四種作物根系分泌物對煙草疫霉的抑菌活性分析

孟玉芳 焦永鴿 張立猛

摘要

通過分析玉米、大蒜、茴香和油菜4種作物根系分泌物對煙草疫霉的抑菌活性，發現這4種作物根系表現出很強的化感作用，根系分泌物能在短時間內迅速地殺死煙草疫霉的游動孢子，抑制其萌發。其中，玉米根系分泌物在最高濃度2.59 mg/mL時，對疫霉休止孢萌發的抑制率高達100%;大蒜根系分泌物濃度為0.1 mg/mL時，20 min內能完全抑制游動孢子的游動。分析4種作物根系對游動孢子的趨化作用發現，茴香、油菜對疫霉游動孢子的吸引活性最強，T0最高分別為76.3、68.7，玉米、大蒜次之。以上結果為建立“以生物多樣性為基礎，克服煙草土傳病害連作障礙”的病害防治新模式提供有力的理論支撐。

關鍵詞

根系分泌物; 煙草疫霉; 煙草黑脛病

中圖分類號：

S 435.72

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017444

Inhibitory activity of root exudates from four crops against Phytophthora nicotianae

MENG Yufang， JIAO Yongge， ZHANG Limeng

（Yunnan Tobacco Company， Yuxi Branch， Biological Control for Tobacco Diseases and Insect

Pests Engineering Research Center of China Tobacco， Yuxi 653100， China）

Abstract

Root exudates from four species of crops， including maize， garlic， fennel and canola， were used to test the inhibitory activity against Phytophthora nicotianae. The results indicated that the four crops root exudates showed inhibitory activity against the release of zoospores from sporangia， the germination of cystospore. At the highest concentration of 2.59 mg/mL， the maize root exudates， could inhibit the germination of the resting spores with the inhibition rate of 100%. At 0.1 mg/mL of the garlic root exudates， the germination of zoospores was totally stopped in 20 min. The chemotactic activities analysis revealed that the four crop roots could attract a large number of zoospores of P.nicotianae from especially the fennel and canola root， with the highest T0 values of 763 and 68.7 respectively， followed by maize and garlic. On the basis of biological diversity， these results are useful for us to rotate maize， garlic， fennel and canola with tobacco for tobacco black shank control.

Key words

root exudate; Phytophthora nicotianae; tobacco black shank

煙草黑脛病是煙草的毀滅性病害，由寄生疫霉煙草變種Phytophthora parasitica var. nicotiane引起。19世紀末 van Breda de Haan在印度尼西亞的爪哇對黑脛病進行了首次報道[1]。煙草黑脛病具有分布廣、發病率高、危害重、防治難等特點，現已遍布全國，成為我國煙草上最嚴重的病害之一。煙草黑脛病菌的游動孢子形成速度快且數量大，侵染煙株后潛育期短、發病快，在一個生長季節可以發生多次再侵染，此外，該病有時還與其他病害混合發生，防治難度較大。長期以來，對該病害采取種植抗病品種和化學防治為主、栽培措施為輔的綜合防治方法。但隨著連作煙田面積擴大以及連作年限的增長，加之化學藥劑的長期不合理使用，抗病品種抗性的喪失，病原菌的變異分化以及抗藥性的產生，煙草黑脛病普遍具有加重流行的趨勢。

目前，生產上為了減輕該病造成的損失，不斷嘗試綜合運用化學防治、農業防治、抗病育種、生物防治等多種方法控制煙草黑脛病，其中化學藥劑的依賴程度依然較高，但由于其所用藥劑作用機制和作用位點相近，很容易產生耐藥性，生產上急需替代藥劑。由于生物防治相較于化學藥劑防治，具有無污染、無殘留等優點，已成為黑脛病防治研究的熱點之一，目前大量研究集中在細菌、放線菌類生防菌對煙草黑脛病的防治作用[2]。

根系分泌物是植物根系釋放到根際環境中的有機物質的總稱，對土壤結構形成、土壤養分轉化、植物養分吸收、土壤微生物分布、環境脅迫緩解等方面都具有重要作用[3]。同時，研究也發現黃瓜、大豆、煙草等忌連作作物的連作障礙現象與根系分泌物中的化感物質密切相關，根系分泌的抑菌物質對土壤中非寄主病原菌的抑制是減輕病害的主要原因之一，在生產實踐上間作和輪作也是減輕土傳病害的途徑之一[4]。張立猛等研究報道玉米在生長過程中可以通過根系源源不斷地分泌苯并嗪類化合物到根際土壤中抑制煙草疫霉菌的生長[5]。廖靜靜等報道大蒜類似根緣細胞水培液對辣椒疫霉菌游動孢子游動和孢子囊釋放都具有顯著的抑制活性[6]。

但是，由于土壤中微生物對根系分泌物的吸收、利用以及根系分泌物本身組分復雜、含量低，種類和數量隨植物類型、根際環境而異[7]等特點，使得根系分泌物難以有效提取，目前已報道的收集根系分泌物的方法按不同的分類方法有多種劃分[8]。本研究選擇的收集方法為連續性根系分泌物收集系統[9]，能夠在現實栽培中，對根系不造成傷害的情況下，實時、連續、準確地收集根系分泌物。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）大蒜Allium sativum品種為‘呈貢白蒜，購于市場，蒜瓣于移栽前7 d放于室內讓其自然露芽備用;

（2）玉米‘海禾1號種子購于市場;

（3）油菜‘云油雜2號種子購于市場;

（4）茴香種子為云南玉溪當地品種，購于市場。

供試菌株：寄生疫霉煙草變種P.parasitica var. nicotianae，由本實驗室分離自田間發病植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 根系分泌物收集、提取

大蒜、玉米、油菜和茴香根系分泌物的收集主要采用自動循環裝置法。首先將玻璃棉、石英砂用2 mol/L的HCl浸泡24 h，用自來水沖洗至pH約為7，161℃干熱滅菌4 h后裝入無底玻璃瓶中。其次，在石英砂中加入0.5倍Hoagland營養液至飽和，種入大蒜蒜瓣或已發芽玉米種子（蒜瓣和玉米種子用2.5%次氯酸鈉分別浸泡15 min和5 min，無菌水沖洗3次），每個無底玻璃瓶中種植5株，每種設置8個重復。然后用錫箔紙將無底玻璃瓶及瓶口包裹，待大蒜和玉米發芽之后，在對應位置扎小孔讓其穿出錫箔紙生長;由于油菜和茴香前期生長較大蒜和玉米緩慢所以要先進行育苗，待長成4葉1心時再對根系進行清洗及移栽至根系分泌物收集裝置中進行收集。

大蒜和玉米生長過程中，從第二周開始每周補充1次Hoagland營養液至飽和，期間補充蒸餾水保持水分。待大蒜和玉米約生長至10～15 cm;油菜和茴香長至4葉1心時，放盡玻璃瓶中營養液，用自來水沖洗干凈殘余營養液后用無菌水沖洗3次在玻璃瓶底部接上樹脂柱（XAD-4中性交換樹脂用甲醇、乙醚、甲醇分別浸泡24 h后無菌水沖洗干凈）及其他組件，打開閥門和泵連續收集5 d。

1.2.2 根系分泌物對疫霉菌抑菌活性研究

1.2.2.1 玉米、大蒜根系分泌物對游動孢子游動的影響

取配制好的游動孢子懸浮液（濃度：1×106 個/mL）和玉米根系分泌物（0.52、0.26、0.05、0.03 mg/mL）各20 μL， 同時滴加到凹玻片上，在20℃黑暗條件下保濕培養，分別在1、2、5、10、15、20 min后在顯微鏡下觀察游動孢子生成休止孢的情況，以0.001 mg/mL 25%嘧菌酯懸浮劑作為農藥對照，每個濃度重復4次，觀察游動孢子游動和靜止的情況，計算游動孢子的休止率。

取配制好的游動孢子懸浮液（濃度：1×106個/mL）和大蒜系列濃度根系分泌物（0.1、0.02、0.01、0.002、0.001、0.0002 mg/mL）各20 μL，同時滴加到凹玻片上，在20℃黑暗條件下保濕培養，分別在1、5、20、40、60、80、100、120和140 min后在顯微鏡下觀察游動孢子生成休止孢的情況，以0.001 mg/mL 25%嘧菌酯懸浮劑作為農藥對照，每個濃度重復4次，觀察游動孢子游動和靜止的情況，計算游動孢子的休止率。

1.2.2.2 玉米、大蒜根系分泌物對休止孢萌發的影響

將配制好的游動孢子懸浮液（濃度：1×106個/mL）在渦旋儀上振蕩10 min，取游動孢子懸浮液和玉米根系分泌物（2.59、0.52、0.26、0.05、0.03 mg/mL）、大蒜系列濃度根系分泌物（0.001、0.006、0.01、0.06、0.1 mg/mL）各20 μL同時滴加到凹玻片上，在20℃黑暗條件下保濕培養，3 h后在顯微鏡下觀察萌發休止孢的數量，每個濃度重復4次，每重復計算100個休止孢的萌發率。

1.2.3 4種作物根系對疫霉菌游動孢子的化感趨化作用

在直徑9 cm的培養皿中放置已濕熱滅菌的濾紙，將4種作物種子用2.5%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗3次，放置在無菌水潤濕的濾紙片上，保濕培養至根系伸長約20～30 mm。將植物根系放置在U型槽中，在槽中加入疫霉游動孢子懸浮液（濃度：1×106個/mL），在0、5、10、15、20 min觀察游動孢子對各種植物根系的趨化活性，并拍照統計。

不同作物根尖對疫霉菌游動孢子的化感趨化作用可根據不同時間孢子聚集的數量，按照下列公式計算出CR和T0，用CR和T0表示疫霉菌孢子的趨化性[10]，即根系對疫霉菌孢子的吸引能力。CR>1表示為吸引增多趨勢;CR<1表示為排斥減少趨勢。T0>0表示為吸引增多趨勢;T0<0表示為排斥減少趨勢。

CR=處理孢子總量/對照孢子總量;

T0=（處理孢子總量-對照孢子總量）/（處理孢子總量+對照孢子總量）×100。

1.3 數據統計與分析

針對不同處理的試驗數據，采用SPSS數據分析軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 玉米根系分泌物對游動孢子游動和休止孢萌發的影響

玉米根系分泌物對游動孢子游動和休止孢萌發都具有較強的抑制作用。玉米根系分泌物在最高濃度時，對疫霉菌休止孢萌發的抑制率高達100%，而對游動孢子的游動，根系分泌物的抑菌活性高于0001 mg/mL的25%嘧菌酯SC（表1～2）。

表1 玉米根系分泌物對疫霉菌游動孢子游動的影響1）

Table 1 Effect of maize root exudates on the zoospore of Phytophthora nicotianae

1） 全部游動孢子靜止為-; 70%以上游動孢子靜止為+; 30%～70%的游動孢子靜止為++; 30%以下的游動孢子靜止為+++; 沒有游動孢子靜止為++++。

“-” indicates all zoospores stationary.“+” indicates more than 70% of the zoospore stationary. “++” indicates 30%-70% of the zoospore stationary. “+++” indicates less than 30% of the zoospore stationary.“++++” indicates no rest zoospores stationary.

表2 玉米根系分泌物對疫霉菌休止孢萌發的影響1）

Table 2 Effect of maize root exudates on the germination of

cystospore of Phytophthora nicotianae

1） 表中數據為平均值±標準差。

Data in the table are average±SD.

2.2 大蒜根系分泌物對疫霉菌游動孢子游動和休止孢萌發影響

大蒜根系分泌物對疫霉菌游動孢子游動和休止孢萌發都具有很強的抑制作用。濃度0.1 mg/mL時，在20 min內能完全抑制游動孢子的游動，對休止孢萌發的抑制率達到了70.45%（表3～4）。

2.3 4種作物根系對疫霉菌游動孢子的化感趨化作用

試驗結果表明，玉米和大蒜根能吸引大量的游動孢子，且游動孢子在靠近玉米和大蒜根系之后停止游動，最終裂解（圖1）。茴香根、油菜根也表現出很強的吸引作用（圖2）。

表3 大蒜根系分泌物對疫霉菌游動孢子游動的影響1）

Table 3 Effect of garlic root exudates on the zoospore of Phytophthora nicotianae

1） 全部游動孢子靜止為-; 70%以上游動孢子靜止為+; 30%～70%的游動孢子靜止為++; 30%以下的游動孢子靜止為+++; 沒有游動孢子靜止為++++。

“-” indicates all zoospores stationary.“+” indicates more than 70% of the zoospore stationary. “++” indicates 30%-70% of the zoospore stationary. “+++” indicates less than 30% of the zoospore stationary.“++++” indicates no rest zoospores stationary.

表4 大蒜根系分泌物對疫霉菌休止孢萌發的影響1）

Table 4 Effect of garlic root exudates on the germination of

cystospore of Phytophthora nicotianae

1） 表中數據為平均值±標準差，同列不同小寫字母表示不同處理之間在0.05水平存在顯著差異（n=4）。

Data in the table are the means±SD，The different small letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level （n=4）.

圖1 玉米和大蒜根系對疫霉菌游動孢子化感趨化作用

Fig.1 Chemotaxis effect of corn and garlic root system on

zoospores of Phytophthora nicotianae

圖2 茴香和油菜根系對疫霉游動孢子化感趨化作用

Fig.2 Chemotaxis effect of fennel and canola root system on zoospores of Phytophthora nicotianae

通過比較4種作物根系周圍游動孢子數目與對照的差異，定量分析根系對游動孢子的趨化作用。結果表明，茴香根系在處理10 min時，油菜根系在處理5 min時對疫霉菌游動孢子的吸引活性最強，T0最高分別為76.3、68.7（表5）。其次，大蒜、玉米對游動孢子的吸引活性較弱。

表5 不同作物根系對疫霉菌游動孢子的化感趨化活性

Table 5 Chemotactic activities of different roots against zoospores of Phytophthora nicotianae

3 討論

3.1 根系分泌物與煙草疫霉菌的化感效應

植物根系分泌物的產生是植物根部長期進化的結果， 是適應環境的一種體現，不是一個完全被動的過程，根系分泌物介導的植物-微生物互作關系變化對于土壤肥力、健康狀況， 以及植物生長發育有著極其重要的作用，植物的他感作用、連作障礙、連作促進或是間套作增產等都是由其根系分泌物介導的植物與特異微生物共同作用的結果[11]。文獻研究報道利用HPLC-MS在玉米組織和根系分泌物中均檢測到苯并嗪類化合物丁布及其降解產物門布的存在，并證明門布對煙草疫霉的菌絲生長也具有明顯的抑制作用[5];大蒜品種的根系分泌物對黃瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌菌絲生長及孢子萌發均表現出抑制作用[12];油菜根系分泌物對不同作物及不同生長特性的化感效應具有不同的選擇性，合理搭配油菜作物的間、套、輪作是其取得優質、高產栽培的關鍵技術[13]。

本文以烤煙種植易感黑脛病為重點，通過對玉米、大蒜、油菜和茴香的根系分泌物對煙草疫霉的抑菌活性分析研究，發現4種作物根系的分泌物對游動孢子游動和休止孢萌發都有不同程度的抑制特性;觀察4種作物根系對疫霉菌游動孢子的化感趨化作用，發現4種作物均能吸引大量的游動孢子，且游動孢子在靠近根系之后停止游動，最終裂解，其中茴香、油菜對疫霉游動孢子的吸引活性最強。

3.2 作物多樣性種植模式對病害的控制應用

本文對多種植物輪作控病原理進行研究，玉米、大蒜、油菜和茴香根系分泌物均能有效地殺滅土壤中病原菌，減少烤煙種植期間病原菌的初侵染來源，有效地控制黑脛病的危害。而利用作物根系能分泌化感物質的特性進行合理的輪作或間作，對實現烤煙病害的生態防控起到積極的推動作用。如在烤煙種植過程中，可采用烤煙—油菜（小春）—烤煙輪作、烤煙—玉米（大春）—油菜（小春）—烤煙輪作等模式，或開展烤煙—玉米（大春）—油菜（小春）—烤煙輪作模式，來降低黑脛病的危害，提高煙葉的品質和產量，達到控病增產的效果。

本研究為建立“以生物多樣性為基礎，克服煙草土傳病害連作障礙”的病害防治提供了探索的新模式，而利用生物多樣性模式的長效控病機制，最終形成簡便、有效的克服煙草土傳病害的生物多樣性綜合防病措施將是未來綠色農業發展的重要方向。

參考文獻

[1] JACOB VAN BREDA DE HAAN. de Bibitziekte in de Deli-Tabak： Veroorzaakt Door Phytophthora nicotianae [M]. Batavia--s Gravenhage， G. Kolff & Co.， 1896.

[2] 藺忠龍，郭怡卿，浦勇，等.病蟲害生物防治技術最新研究進展[J].中國煙草學報，2011，17（2）：90-94.

[3] 李汛，段增強.植物根系分泌物的研究方法[J].基因組學與應用生物學，2013，32（4）：540-547.

[4] 吳林坤，林向民，林文雄.根系分泌物介導下植物-土壤-微生物互作關系研究進展與展望[J].植物生態學報，2014，38（3）：298-310.

[5] 張立猛，方玉婷，計思貴，等.玉米根系分泌物對煙草黑脛病菌的抑制活性及其抑菌物質分析[J].中國生物防治學報，2015，31（1）：115-122.

[6] 廖靜靜，張立猛，張瀟丹，等.大蒜類似根緣細胞生物學特性及其對辣椒疫霉菌的抑制活性[J].植物保護，2015，41（5）：39-45.

[7] 涂書新，孫錦荷，郭智芬，等.植物根系分泌物與根際營養關系評述[J].土壤與環境，2000，9（1）：64-67.

[8] NEUMANN G， GEORGE T S， PLASSARD C. Strategies and methods for studying the rhizosphere-the plant science toolbox[J]. Plant and Soil， 2009， 321（1/2）： 431-456.

[9] TANG C S， YOUNG C C. Collection and identification of allelopathic compounds from the undisturbed root system of bigalta limpograss （Hemarthria altissima） [J]. Plant Physiology， 1982， 69（1）： 155-160.

[10] 朱書生，楊敏，鄧維萍，等.一種利用玉米根系與疫霉菌相克原理生態控制作物疫病蔓延的方法：CN104429479A [P].2015-03-25.

[11] EISENHAUER N， SCHEU S， JOUSSET A. Bacterial diversity stabilizes community productivity [J]. PLoS ONE， 2012， 7（3）： e34517.

[12] 周艷麗， 王艷. 大蒜根系分泌物的化感作用[J]. 應用生態學報， 2011，22（5）： 1368-1372.

[13] 楊瑞吉.油菜根系分泌物對不同作物幼苗生長的化感效應[J].生態環境，2006，15（5）：1062-1066.

（責任編輯： 楊明麗）