黃淮麥區部分小麥品種(系)重要產量性狀全基因組關聯分析

趙丹陽，朱 婷,王衛東，張思妮，夏雪姣，翟曉光，丁 勤，馬翎健

(西北農林科技大學，陜西楊陵 712100)

基因關聯分析是以連鎖不平衡為基礎，對自然群體中目標性狀的遺傳變異與基因多樣性進行關聯，篩選與表型變異相關分子標記的一種策略，具有低耗費、高精度、強實用性等優點，目前已廣泛應用于水稻[1]、小麥[2]、玉米[3-6]、油菜[7]等作物遺傳育種研究。近年來，小麥的關聯分析研究主要圍繞株高、穗粒數、可育小穗數、千粒重等產量性狀進行。如Wu等[8]對黃淮麥區175份小麥的株高、產量相關性狀進行了關聯分析，從中篩選出23個顯著關聯的SSR標記。有研究發現，Xwmc134與小麥株高相關，在WMC363～Xgwm234之間含控制穗長的QTL位點，Xwmc710、Xbarc235和Xbarc252能以高頻率從親本遺傳于后代，且與穗粒數、產量緊密相關，Xubc873a～Xwmc63區間內有與可育小穗數相關的QTL位點，Wmc48與粒重相關[9-13]。此外，Mir等[14]還發現了11個與小麥粒重關聯的新型分子標記。但是，關于小麥株高、穗長、單株穗數、可育小穗數、穗粒數、千粒重等多個重要產量性狀與分子標記的關聯分析研究仍較少。

本研究主要以52份黃淮麥區小麥品種(系)為材料，對6個重要產量性狀進行兩年多點表型鑒定，利用覆蓋小麥21條染色體全基因組的226個SSR標記和22個SNP標記進行關聯分析，以期為小麥產量性狀相關等位變異的鑒定挖掘及分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的52份小麥材料中，包括24個黃淮麥區主栽品種和28個西北農林科技大學近期培育的小麥品系。其中，黃淮麥區主栽品種中，陜西有7個，河南有8個，山東有5個，河北有2個，安徽和江蘇各有1個(表1)。

1.2 表型鑒定

2015年將52份供試材料種植于陜西楊凌西北農林科技大學和河南南陽農科院試驗站。2016年將供試材料分別種植于陜西楊凌西北農林科技大學試驗站、江蘇宿遷中江種業育種基地與河南駐馬店農科院試驗站。按照完全隨機區組設計，單行種植，行長、行距、株距分別為1.5 m、20 cm、10 cm，每行點播15粒種子，并進行常規田間管理。2016年5月下旬于陜西楊凌、河南南陽和2017年5月下旬于陜西楊凌、河南駐馬店、安徽宿遷調查供試材料表型性狀。每地每個材料隨機選取5個單株測量其株高、穗長，并對單株穗數、可育小穗數及穗粒數進行計數。收獲時每行隨機收取10個單穗，脫粒、烘干、去除碎粒后稱量得其千粒重。

1.3 標記選擇及基因型鑒定

通過參考文獻和GrainGenes數據庫(http://avena.pw.usda.gov/GG2/index. shtml)篩選出覆蓋小麥全基因組的365對SSR引物，初篩后最終獲得226對多態性引物(A基因組55個，B基因組73個，D基因組98個)。通過查閱文獻和NCBI數據庫篩選89對SNP引物對供試小麥材料進行KASP(kompetitive allele specific PCR)基因分型，篩選出多態性高的22對SNP引物(A基因組10個，B基因組5個，D基因組7個)。

2016年11月在陜西楊凌小麥育種中心實驗基地取小麥嫩葉，采用改良CTAB法[15]提取DNA，DNA提取液進行質控后稀釋備用。

SSR標記鑒定步驟如下：(1)SSR實驗操作程序和PCR擴增參照簡化的SSR分析體系[16]操作；(2)擴增產物用6%非變性聚丙烯酞胺凝膠(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)分離，以改進的銀染方法[17]染色并于凝膠成像儀中觀察讀帶；(3)分析每對SSR引物膠圖，因為在150～300 kb間條帶多樣性豐富，從此區間讀取3條多態性帶，并按照軟件DataFormater“0，1”帶型格式[18]整理SSR信息。SNP標記鑒定均參照AS-PCR[19]擴增及產物檢測的方法，用384孔板進行高通量PCR，于微孔板熒光分析儀得到所需數據。由于SNP引物較少，且其分型結果與SSR 標記格式不同，后續分析將其轉化為SSR的“0，1”格式進行軟件分析。

表1 試驗材料編號及其來源Table 1 Origin and name of the tested materials

1.4 數據分析

運用SPSS 22.0對表型數據進行描述性統計分析和方差分析，作出5種環境的表型分析表。通過DataFormater軟件將，標記的“0，1”帶型轉為“bp”帶型及其他分子遺傳學軟件可導入的格式。利用Powermarker 進行遺傳多樣性分析，獲得每個分子標記的基因多樣性指數、等位變異豐富度及多態性信息含量(polymorphism information content,PIC)等信息。并進行UPGMA聚類分析，結合iTOL(http://itol.embl.de/)網站進行聚類圖的繪制與修飾。通過NTsys軟件分析獲得供試材料的親緣關系矩陣，并進行親緣關系聚類熱圖繪制，并與UPGMA聚類結果進行比對。運用Structure 軟件估計52份材料的群體結構，基于貝葉斯方法得到每個材料對應的Q值，將52份材料劃分為不同的亞群，繪制群體遺傳結構圖。

1.5 全基因組關聯分析及優異等位變異的發掘

基于供試材料表型數據分析與分子標記遺傳多樣性、聚類、親緣關系及群體結構分析，利用獲得的表型數據、群體Q值、親緣關系Kinship值、標記帶型等與TASSEL 3.0 軟件結合其混合線性模型(multilevel linear model， MLM)進行表型性狀與標記間的關聯分析。通過關聯分析獲得關聯位點，進行優異等位基因的發掘并計算在P<1/N時對標記位點表型變異的解釋率(R2)。

2 結果與分析

2.1 表型統計結果分析

描述性統計分析(表2)表明，不同地區間、性狀間小麥兩年表型性狀差別均較大。在地區間，產量由河南、安徽、陜西依次遞減，6個重要產量性狀的這種趨勢基本一致；在性狀間，穗長和單株穂數的變異系數最大，可育小穗數和穗粒數次之，千粒重和株高的變異系數最小。方差分析(表3)表明，6個性狀在不同地區間和材料間均存在顯著或極顯著差異，說明這些小麥性狀受環境和遺傳因素影響均較大。

表2 供試群體6個產量性狀表型的描述性統計分析Table 2 Descriptive statistics of six yield traits of 52 wheat accessions

表3 52個小麥品種(系)6個性狀兩年表型數據方差分析Table 3 ANOVA for six phenotypic traits in 52 wheat varieties(lines) observed in two years

2.2 標記遺傳多樣性結果分析

利用均勻分布于小麥21條染色體上的248個分子標記，在52份小麥材料中共檢測到899個等位變異(表4與圖1)，每個位點平均檢測到3.625個等位變異，變化范圍為1～5。遺傳多樣性指數的變化范圍為0.301～0.715，平均值為0.586，其最大和最小值的分子標記分別是gwm635和barc204；多態性信息含量(PIC)變化范圍為0.280～0.666，平均值為0.510，達到高度多態的水平(PIC≥0.5)，PIC最大和最小值的分子標記分別為gwm635和barc204。在基因組水平上，B染色體組的等位變異總數和平均等位變異豐富度均最高，D染色體組次之，A染色體組最低；A染色體組的遺傳多樣性指數和多態性信息含量(PIC值)最高，B染色體組中等，D染色體組最低。

表4 248個標記在供試小麥群體基因組水平上的遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity analysis among genome in 52 wheat accessions

圖1 等位變異數與遺傳多樣性指數(GI)和多態性信息含量(PIC)的散點圖Fig.1 Scatter plot of allele number，gene diversity(GI) and PIC

2.3 供試材料群體結構結果分析

利用Structure 2.3.4軟件分析，得到52份小麥材料群體結構Q值與極大似然值LnP(D)，由LnP(D)計算不同K值間的ΔK來確定最佳K值(圖2)。當K=4時，LnP(D)改變平滑趨勢且ΔK曲線具有明顯的拐點，即52個材料被劃分為4個亞群(圖3)，4個亞群所含品種數分別為12、24、7、9，占總材料數的比例分別為23.1%、46.1%、13.5%和17.3%。分群結果表明，各類群中材料與品種(系)育成時間及地理來源不完全相關。

通過比較UPGMA聚類結果(圖4)與利用NTsys得到的親緣關系(圖5)，所得群體遺傳結構分類結果基本一致，也將群體基本劃分為4個亞群，2種分類方法所劃分的亞群中，僅編號為20、32、33、42的4個品種(系)分群有差異。

2.4 全基因組關聯定位

經關聯分析，在兩年多點共5種環境下，與供試材料的株高、穗長、單株穗數、可育小穗數、穗粒數及千粒重顯著關聯的位點有13個，表型變異解釋率(R2)為6.74%～82.71%(表5)。與株高、穗粒數、千粒重關聯的位點各有1個，分別位于3A、4A、7D染色體上；與穗長關聯的位點有5個，其中位于A、B染色體組的位點各2個，位于D染色體組的位點1個；與單株穂數關聯的位點有5個，其中位于A染色體組3個，位于D染色體組的位點有2個；與可育小穗數關聯的分子標記有3個，其中位于B染色體組的標記2個，D染色體組的標記1個。其中分子標記xwmc580、xwmc181與穗長、單株穗數均顯著關聯，貢獻率最高的分子標記為wmc331。與產量性狀顯著關聯的SNP標記及其引物序列已列出以供參考(表6)。

圖2 LnP(D)、ΔK估算群體結構圖Fig.2 Estimation of population structure by the likelihood distribution and delta K values(ΔK)

圖3 利用 Structure 軟件對供試材料的群體遺傳結構Fig.3 Population structure(K=4) of materials by Structure software

圖4 52份供試小麥材料聚類圖Fig.4 Dendrogram of 52 wheat accessions by UPGMA cluster analysis

圖5 52份供試小麥材料親緣關系聚類熱圖Fig.5 Image clustering of 52 wheat accessions by Kingship analysis

表5 與產量性狀顯著相關的標記位點Table 5 SSR loci significantly associated with yield-related traits in wheat

表6 所得顯著關聯SNP標記及其引物序列Table 6 SNP loci and primer sequences significantly associated with yield-related traits in wheat

3 討 論

在遺傳多樣性評價體系中，平均等位變異豐富度、基因遺傳多樣性、多態性信息含量均被普遍應用[20]。本試驗所選分子標記平均等位變異豐富度分布(B>D>A)和遺傳多樣性指數與多態性信息含量分布(A>B>D)不同，且與人們普遍認為的小麥基因組遺傳多樣性B>A>D有所差異。究其原因，一方面可能由于分子標記只是一段較短DNA序列，不能代表所有基因在染色體上的分布特征，當所用標記數量不同時，分析結果可能不同[21]。如李 遠等[22]用86對與趙 檀等[21]用231對多態性SSR引物對相同小麥材料遺傳多樣性的分析結果差異明顯。另一方面，本研究的試驗群體較小，且多為陜西省培育的小麥品種(系)，可能存在部分基因座，盡管等位變異較少，但其PIC值仍然很高，即引物的多態性信息含量高，其等位變異位點不一定多。趙 檀等[21]、ZHANG等[23]研究認為，評價種質資源遺傳多樣性不能僅僅用平均等位變異豐富度或基因多樣性、多態性信息含量作為評判標準，而有必要對各指標進行權衡。 因此，本研究初步認為，由 52個黃淮麥區小麥品種(系)組成的試驗群體，其遺傳多樣性水平在三個染色體組間沒有明顯差異。

本試驗將52份供試材料分為4個亞群，此分群結果表明各類群中材料與品種(系)育成時間及地理來源不完全相關，分析其原因可能是黃淮麥區生態條件較為相似，育種材料共享力度加大，常用骨干親本有限，導致了黃淮麥區品種(系)間親緣關系較近，遺傳多樣性降低。今后，育種工作應重視擴大引進與利用國外資源，挖掘中國豐富的地方種質資源，不斷拓寬改造中國小麥的遺傳基礎。

本研究中與穗長、單株穗數均顯著相關的標記為xwmc181、xwmc580。要燕杰等[24]發現，xwmc580與8個品質和產量性狀在0.01水平上顯著相關，且其被推測與較好綜合農藝性狀[25]有關聯，在長穗偃麥草研究及小麥遺傳改良中有重要利用價值，這與本研究結果一致。xwmc181被定位到2DL，且與小麥黃花葉病毒的抗性相關[26]。此標記也與直立和下披旗葉性狀連鎖[27]。本試驗中與穗長顯著相關的標記還有xwmc719，其與水稻植株的矮化性狀關聯[28]，也與小麥抗條銹病性狀[29-30]緊密連鎖。gwm296、barc178和xwmc331與可育小穗數顯著相關。在這三個分子標記中，barc178與小麥花前持續時間呈正相關[31]，結合本試驗檢測結果，推測該區段基因可能與小麥開花期發育相關；gwm296不僅與雌性不育小麥XND126育性基因連鎖[32]，還與植株的抗葉銹病基因 Lr22a>緊密連鎖[33]，與抗葉銹病基因 LrSV1>關聯[34]；xwmc331被定位于4D染色體42.9 cM處[35]，其與耐鋁[36]、抗赤霉病[37]等性狀相關聯，是用于小麥育種輔助選擇優良分子標記。與千粒重顯著相關標記gwm44位于7DS上，是識別小麥持久抗條銹病基因 Yr18>關聯的候選標記[38]。綜上所述，本試驗中與產量性狀顯著關聯位點與前人利用 SSR、QTL等定位位點的位置相同或接近，但所關聯性狀有所不同。

作為第三代分子標記，SNPs的缺失率明顯低于SSRs，SNP具有穩定遺傳、高效、快捷的特點[39]。本試驗綜合兩者，用226個微衛星標記與22個SNP標記進行遺傳多樣性及關聯分析，其結果更為可信。已有研究表明,在關聯分析中同時使用Q值(群體結構信息)和Kinship值(品種間親緣關系)的MLM(Q+K)模型優于單獨使用Q值或Kinship值的GLM(Q)和MLM(K)模型[40-41]。 為了提高所關聯標記的可靠性，本研究對基因型數據采用了Tassel軟件中的混合線性模型MLM(Q+K)進行群體結構的分析，最終獲得顯著關聯的13個分子標記，這些優異等位基因有待進一步的精確定位，可為后續相關性狀基因的關聯定位提供依據。