紅景天AG基因(RrAG)的電子克隆及生物信息學分析

葛春艷， 李雪彤， 劉福鵬， 鄭大浩， 吳委林

(1.延邊大學農學院，吉林延吉 133002； 2.長春科技學院，吉林長春 130600)

紅景天(Rhodiolarosea)為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)多年生草本植物，是我國傳統珍稀藥用植物，具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗缺氧、抗疲勞、抗病毒、抗腫瘤、抗應激反應、增強機體免疫力、改善心血管系統功能等藥理作用，廣泛應用于軍事、航天、醫藥、功能性食品、化妝品等保健和臨床方面[1-4]。目前，相關研究主要關注紅景天形態特性、栽培措施、紅景天苷的生物合成以及藥理與藥性方面，未見關于其花器官發育等方面的相關研究。研究者依據大量花發育的研究結果提出ABCE模型，其中C+E基因控制雌蕊發育，而C組基因中的AG基因的弱突變體為心皮發育缺陷但雄蕊的發育正常，說明雄蕊和心皮屬性的確定與發育對AG基因表達水平的要求不同[5]。

電子克隆(insilicocloning)技術是近幾年來新發展的一種新的基因快速克隆方法，基本原理是基于已建立的核酸序列與蛋白質序列數據庫，利用計算機技術與生物信息學工具進行比對、拼接及分析而快速獲得相應的功能基因。該技術具有高效率、低成本且針對性強等優點[6]，已被研究者們在基因克隆之前廣泛使用。但是，當前研究者基本以已知相關物種的EST(expressed sequence tags，表達序列標簽)序列在基因組數據庫中進行反復比對、拼接到沒有可供延長的序列為止，得到最終的重疊群(Contig)，再進行開放閱讀框的查找及后續相關生物信息學分析。隨著測序技術與生物信息軟件的發展，已有大量已拼接好的轉錄組數據庫，本研究將擬南芥AG基因在紅景天轉錄組數據庫中進行比對，得到紅景天全長AG基因，減少了反復比對與拼接的麻煩以及可能出現的錯誤，并對其進行相應的生物信息學分析，以期為后續相關功能基因的克隆與功能分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 電子克隆獲得紅景天AG基因序列

將擬南芥AG基因(NP_001190766.1)在中國國家基因數據庫(https：//db.cngb.org/blast/blastn/)中選擇tblastn程序在紅景天轉錄組數據庫中進行比對，將比對得到的多條序列逐一通過BLAST軟件進行在線比對分析與Amigo(http：//amigo1.geneontology.org/cgi-bin/amigo/blast.c-gi)注釋分析，最終確定紅景天AG基因(Rhodiola rosea AGAMOUS，簡稱RrAG)。

1.2 生物信息學分析

(1)將已得到的RrAG基因的mRNA序列利用SeqBuilder軟件分析開放閱讀框(open reading frame，簡稱ORF)與美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站的CD-search(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線分析其編碼蛋白的保守結構域(conserved domains)。

(2)用Protparam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的一級結構及其理化性質；用HMMTOP(http：//www.enzim.hu/hmmtop/)、TMpred Server(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)與TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜結構域分析；用SignalP 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預測；用TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進行導肽分析；用Protfun 2.2 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)預測蛋白質功能；利用在線軟件PSORT(http：//psort.hgc.jp/form.html)進行亞細胞定位分析。

(3)用蛋白質數據庫PDB網站的3D Structure Viewers在線可視化工具(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do#Category-visualize)預測其三級結構。用NetPhos(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測磷酸化位點。

2 結果與分析

2.1 紅景天AG基因序列的獲得及序列分析

將擬南芥AG基因(登錄號：NP_001190766.1)序列作為參考序列，在中國國家基因數據庫的千種植物數據庫(https：//db.cngb.org/blast4onekp/blast)中通過選擇tBLASTn程序[Expectation Value(期望值，簡稱E值)<0.001]，在紅景天轉錄組數據庫中進行比對，得到相似度較高的16條序列，并利用BLAST在線軟件分析了每條相似序列，最終確定了每條序列的基因功能。表1的結果表明，僅ZJUL-2061267為AG基因，通過在線Amigo進行注釋分析，進一步說明ZJUL-2061267為紅景天的AG基因(RrAG)。

使用SeqBuilder軟件分析可知，ZJUL-2061267基因全長為1 037 bp，含有789 bp的開放閱讀框，編碼262個氨基酸(圖1)。經NCBI網站CCD在線預測表明，該基因包含MADS_MEF2_like(MADS家族，登錄號：cd00265)與K-box(登錄號：pfam01486)結構域(圖2)，這2個區域對植物的形態建成具有重要作用。

表1 用NP_001190766.1在千種植物數據庫比對得到的顯著相似性序列及基因

2.2 紅景天AG基因編碼氨基酸理化性質及一級結構預測

基于ExPASy網站蛋白質數據庫，利用ProtParam預測ZJUL-2061267蛋白的理化性質，結果表明，該蛋白含有262個氨基酸，分子式為C1 284H2 077N383O420S9，分子質量(MW)為29 888.47 u，由19種氨基酸組成(表2)。其中，絲氨酸(Ser，簡稱S)數量最多，達到11.8%，其次是亮氨酸(Leu，簡稱L)與谷氨酰胺(Gln，簡稱Q)，分別達到8.4%與8.0%，而不含有色氨酸(Trp，簡稱W)、吡咯賴氨酸(Pyl，簡稱O)、硒半胱氨酸(Sec，簡稱U)、天冬氨酸(Asx，簡稱B)、谷氨酰胺(Glx，簡稱Z)與任意氨基酸殘基(Xaa，簡稱X)。該蛋白理論等電點(pI)為9.27，帶負電荷殘基數為30個，帶正電荷殘基數為38個，親水性平均系數(GRAVY值)為-0.851，說明該蛋白屬于親水性蛋白；理論推導半衰期是30 h，不穩定系數為56.28(>40)，說明該蛋白不穩定(表3)。

2.3 紅景天AG基因編碼蛋白跨膜分析及信號肽與功能預測

使用在線軟件HMMTOP、TMpred Server與TMHMM Server v.2.0進行跨膜結構域分析，由圖3、圖4可以看出，該基因編碼蛋白為無跨膜區的膜外蛋白，說明該蛋白為水溶性蛋白，不與膜的疏水部分直接作用；通過在線軟件SignalP 4.1 Server進行信號肽預測表明，該基因無信號肽；通過TagetP 1.1 Server進行預測顯示，該蛋白為葉綠體轉運蛋白(cTP)、線粒體靶向蛋白(mTP)、信號肽的可能性均較小，概率分別僅為0.332、0.103與0.026，而其他蛋白(other)的概率卻達到了0.738，預示其為非分泌蛋白。使用Protfun 2.2 Server分析其蛋白功能，由表4可以看出，其中僅轉錄調節(transcription_regulation)、轉錄(transcription)與信號轉導(signal_transducer)概率大于0.05(P>0.05)，分別為0.107、0.079與0.075，說明該蛋白主要起轉錄調控作用。此外，在Predictprotein網站進行了亞細胞定位預測，表明其定位于細胞核內。綜合以上分析，推測該蛋白為轉錄調控因子。

2.4 紅景天AG基因二級結構與三級結構預測

蛋白質的結構是其活性與功能的重要影響因素之一[7-9]。編碼的氨基酸借助氫鍵作用呈現的線性排列形成線性的二級結構，再由范德華力、氫鍵等相互作用使其進一步折疊形成立體的三級結構。通過使用SOPMA預測紅景天AG基因的二級結構表明，紅景天AG基因編碼的蛋白由α-螺旋、無規則卷曲與延伸鏈構成，其中α-螺旋、無規則卷曲占氨基酸總數的比例較大，分別占48.09%、40.84%，而延伸鏈僅占11.07%(表5)。圖5更為直觀地表明，RrAG基因編碼的蛋白二級結構中，α-螺旋與無規則卷曲所占比例較延伸鏈高。

利用蛋白質數據庫PDB網站的3D Structure Viewers在線可視化工具預測紅景天AG基因編碼蛋白的三級結構得到三維結構。從圖6可以直觀地看出，紅景天AG基因編碼的蛋白屬于MADS-box家族，在第3～57位氨基酸處存在MADS-box結構域，在第58～86位氨基酸處存在Mef2-type功能域結合DNA，并啟動(調控)下游基因的轉錄。

2.5 蛋白質磷酸化位點分析

蛋白質翻譯后的修飾也是其活性的重要影響因素之一，如磷酸化、精氨酸甲基化、糖基化等，其中磷酸化是重要的共價修飾方式之一。通過使用NetPhos(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測紅景天AG基因編碼蛋白的磷酸化位點。由圖7可以看出，該蛋白的蛋白激酶磷酸化位點有36個，分別是21個絲氨酸、8個蘇氨酸(Thr)、7個酪氨酸(Tyr)。

2.6 紅景天AG基因的結構域與親緣進化關系分析

將RrAG基因蛋白序列在NCBI中進行比對(BLASTp)，下載相似性較高的AG蛋白序列，并使用DNAMAN軟件進行序列比對。圖8結果顯示，在MADS-box與K-box 2個保守結構域上，該基因編碼蛋白與其他物種的AG蛋白具有較高的相似度。利用MegAlign與MEGA6.06軟件構建紅景天AG(登錄號：ZJUL-2061267)與麻風樹AG(登錄號：NP_001292936.1)、八仙花AG(登錄號：BAG74745.1)、橡膠樹AG(登錄號：XP_021662672.1)、茶樹AG(登錄號：AID22158.1)、木薯AG(登錄號：XP_021596031.1、XP_021599035.1)、甜椒AG(登錄號：NP_001311689.1)、砂梨AG(登錄號：AJW29028.1、AJW29030.1)、蘋果AG(登錄號：NP_001315863.1)、黑櫻桃木AG(登錄號：ACH72974.1)、棣棠花AG(登錄號：AGZ01978.1)、櫻桃AG(登錄號：AIU94283.1)、蕎麥AG(登錄號：AFO83615.1)、薔薇AG(登錄號：AAD00025.1)、煙草AG(登錄號：NP_001312829.1)、葡萄AG(登錄號：NP_001268097.1、AEG19542.1)、陸地棉AG(登錄號：NP_001314177.1、AAL92522.1)、亞洲棉AG(登錄號：KHG12869.1)、黑白蠟木AG(登錄號：APJ35634.1)、黃金樹AG(登錄號：AJZ73175.1)、板栗AG(登錄號：AAZ77747.1)等植物AG同源蛋白氨基酸序列進化樹，由圖9可以看出，RrAG(登錄號：ZJUL-2061267)與蕎麥AG(登錄號：AFO83615.1)的蛋白序列相似性最高。

表2 ZJUL-2061267編碼蛋白的氨基酸組成

3 討論與結論

目前，由于紅景天的藥用價值已經被人們普遍認識到，其需求量正在逐年增加，其所屬植物的人工栽培也在全國較多地區得到了較大面積的開展。張雪蓮分析發現，從對高山紅景天的重要藥用成分紅景天苷的分析中發現，雄性植株的含量明顯高于雌性植株[10]，因此，研究紅景天花器官發育對于單性植株育種具有重要意義。基于對擬南芥等大量植物花發育同源異型突變體的研究結果，本研究闡釋了4類花器官同源異型基因決定花器官特征屬性(花器官發育的ABCE模型)，其中C+E功能基因控制雌蕊發育[11]。AG基因屬于MADS-box轉錄因子家族，是迄今為止花器官發育中唯一的C類基因，起到花器官形態建成中調控雄蕊與雌蕊發育的作用。

隨著高通量測序技術的發展，電子克隆技術(in silico cloning)已經成為克隆基因簡便、快捷的新方法。目前，人們以EST為探針，通過比對基因組數據庫，結合生物信息學對基因序列及其編碼的蛋白質序列進行結構與功能的預測及分析，已成功從高叢越橘(UFGT基因)[12]、甘蔗(Sckn1基因)[13]、辣椒(actin基因)[14]、高粱(SAMDC基因)[15]、小麥(Cyp450基因)[16]等植物中獲得了新基因。

表3 ZJUL-2061267編碼蛋白的一級結構預測

表4 ZJUL-2061267的主要功能預測

表5 RrAG的二級結構預測

本研究基于紅景天轉錄組數據庫，通過電子克隆技術獲得了紅景天AG基因，生物信息分析及預測表明，該基因全長1 037 bp，包含1個長度為789 bp的開放閱讀框，編碼262個氨基酸，有MADS_MEF2_like與K-box結構域，該蛋白為無跨膜區的定位于細胞核內的不穩定水溶性蛋白，為參與轉錄調控作用的轉錄因子，蛋白的二級結構主要由α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈組成，有21個絲氨酸、8個蘇氨酸、7個酪氨酸為磷酸化位點，該蛋白與蕎麥的AG蛋白親緣關系最近。本研究結果為景天科植物的AG基因的克隆與功能研究等方面的后續研究奠定了基礎。同時，本研究采用基于轉錄組的電子克隆也為未來的電子克隆技術的應用提供了參考。