輔助生殖技術和子代先天性心臟缺陷率相關性隊列研究的Meta分析

歐瑩，華芮，林妙玲，全松

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產科生殖醫(yī)學中心，廣州 510515)

自1978年7月25日首例試管嬰兒在英國誕生后，輔助生殖技術(ART)為越來越多的不孕不育患者解決了生育問題，全世界已有超過540萬兒童在ART后出生[1]。然而其安全性仍存在爭議，其出生子代的出生缺陷問題引起越來越多人關注。先天性心臟缺陷(CHD)是最常見的出生缺陷，我國CHD的發(fā)生率高達14.2‰[2]，且呈逐年上升趨勢。有Meta分析研究表明ART子代CHD風險高于自然受孕的子代[3]。但是缺少針對不同ART對CHD影響的系統(tǒng)Meta分析。本研究采用Meta分析的方法比較ICSI和IVF對子代CHD的影響，為進一步認識ART的子代安全性和促進優(yōu)生優(yōu)育提供一定參考。

資料與方法

一、檢索策略

通過計算機檢索Cochrane Library、PubMed、Medline、EMbase等外文數據庫以及維普(VIP)、中國知網(CNKI)、萬方等國內數據庫，檢索時間從建庫至2017年12月，并通過人工閱讀檢索參考文獻以避免文獻漏檢。發(fā)表研究的語言限制為中文和英文。英文檢索式以PubMed為例：#1：MeSH“assisted reproductive technology”[Title/Abstract]；#2：MeSH“congenital malformations”[Title/Abstract]；#3：MeSH“cohort studies”，結果：#1 And #2 And #3。所有檢索采用主題詞[MEDLINE (MeSH)，EMbase (EMTREE)]與自由詞相結合的方式，所有檢索策略通過多次預檢索后確定。檢索對象限制為人類，文獻類型限于隊列研究(cohort studies)或病例對照(case-control studies)研究。

二、文獻納入及排除標準

納入所有ART與子代CHD關系的隊列研究，語種限于中英文，未限人群。納入標準如下：(1)采用隊列研究設計；(2)暴露因素為接受IVF或ICSI治療；(3)研究對象為接受IVF或ICSI治療后出生的嬰兒；(4)觀察終點為出生時所有類型CHD。

文獻排除標準：(1)同人群重復研究；(2)CHD患者接受ART治療的研究；(3)ART與其他出生缺陷的相關研究；(4)重要資料報告不全且聯系作者未回復者。

三、研究質量評價

采用Newcastle-Ottawa scale (NOS)量表[4]對入選文獻進行評分，評價內容包括：(1)暴露隊列的代表性：①能夠很真實地代表社區(qū)人群的平均或基本可以代表社區(qū)人群的平均 (1分)；②選取特殊人群或沒有說明隊列的來源(0分)。(2)非暴露隊列的選擇：①來自暴露隊列的同一社區(qū)(1分)；②與暴露隊列的來源不同或沒有說明非暴露隊列的來源(0分)。(3)暴露的確定：①可靠的記錄或結構化調查(1分)；②書面的自我報告或無描述(0分)。(4)研究開始前沒有研究對象發(fā)生結局事件(1分)。(5)可比性：①研究控制了最重要的因素(1分)；②控制了其他重要的混雜因素(1分)。(6)結局事件的評估：①獨立的、盲法的評估或鑒定或聯動數據(1分)；②自我報告或無描述(0分)。(7)為觀察到結局發(fā)生，隨訪充分(1分)。(8)隨訪的完整性：全部隨訪或少數失訪或對失訪進行了描述(1分)。

四、資料提取

由3位研究者按照納入與排除標準獨立篩選文獻，采用事先設計的資料提取表提取信息，包括研究項目時間、地點，納入者的一般特征，接受ART類型，結局類型與隨訪時間，并逐一交叉核對。如存在分歧，則通過討論解決；如研究報告的資料不全，則進一步與該研究作者聯系獲取，若最終未獲得相關數據，則剔除該項研究。

五、數據分析

采用Cochrane協(xié)作網提供的RevMan5.3統(tǒng)計軟件對13篇最終納入研究的文獻進行Meta 分析，并根據周期類型及CHD類型進行亞組分析。首先采用Cochrane Q檢驗及I2檢驗對研究間異質性進行檢驗，若P≥0.1說明研究間同質性較好，反之則具有異質性；根據I2值進一步按照25%、50%、75%將異質性劃分為低、中、高3個等級[5]。若研究間同質性較好，則采用固定效應模型進行合并，反之則選擇隨機效應模型，并對其異質性來源進行分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。根據可能出現的異質性因素進行亞組分析，并采用敏感性分析來分析檢驗結果的穩(wěn)定性。同時采用漏斗圖判斷發(fā)表偏倚。

結 果

一、文獻檢索結果

初檢相關文獻1 039篇，其中英文942篇，中文97篇。經過剔除重復文獻并閱讀文題和摘要后剔除明顯不符合納入標準的805篇，然后通過閱讀全文，進一步排除不符合納入標準及無法提取數據的研究217篇，最終納入13篇隊列研究[6-18]進行Meta分析，出生兒共63 147例。其中5篇[7，10，13，17-18]對CHD種類進行了細分。文獻篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖

二、納入研究的基本特征

納入研究包括13篇研究不同ART與CHD關系的英文文獻[6-18]，其中5篇[7，10，13，17-18]對CHD種類進行了細分，包括室間隔缺損(VSD)、房間隔缺損(ASD)、動脈導管未閉(PDA)和法洛(Fallot)四聯征(TOF)。納入的13篇研究均為隊列研究，其中6篇為前瞻性隊列研究，7篇為回顧性隊列研究。各研究特征見表1。

短語結構的句法分析一直是英語的句法分析的主要工作，而依存句法的研究開展則相對滯后。Melchuk在1988年全面系統(tǒng)的研究了英語的依存語法理論，Eisner[1]在1997年最先提出了樹庫轉化的思想，依存樹庫通過短語樹庫轉化得到，并進行了相關的轉化實驗。Eisner在數據轉換時對含連詞的句子進行過濾，其余的句子使用規(guī)則進行自動轉換，得到了90.1%的依存正確率。

表1 納入文獻的基本特征

①：室間隔缺損(VSD)；②：房間隔缺損(ASD)；③：動脈導管未閉(PDA)；④：法洛四聯征(TOF)

ET：新鮮胚胎移植；FET：凍融胚胎移植

三、納入研究的方法學質量評價

由3位研究員獨立進行文獻檢索并提取資料。篩選研究的方法學質量評價采用 Newcastle-Ottawa scale(NOS)量表[4]進行評估，具體包括研究人群選擇、可比性、結果評價3個部分共8個條目。采用星級系統(tǒng)的半量化原則，滿分為9顆星(9分)，13篇研究質量評分≥8分，均為高質量隊列研究。混雜因素設定為女方年齡、病因、不孕年限、多胎妊娠等[19-21]。各研究質量評價結果見表2。

四、Meta分析結果

1.IVF和ICSI對子代CHD發(fā)生率的影響：對13項隊列研究[6-18]中的子代出生CHD進行Meta分析，經異質性檢驗I=19%(<25%)且P=0.26(>0.1)，提示納入的13篇隊列研究無異質性且有較好的同質性，應采用固定效應模型。Meta分析結果如圖2，OR=1.09[95%CI(0.93，1.27)]且Z=1.04(P=0.30)，提示IVF和ICSI兩種授精方式對后代CHD發(fā)生率的影響無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表2 納入文獻的質量評價結果

圖2 兩種授精方式對子代CHD發(fā)生率的影響

2.不同移植周期對子代CHD發(fā)生的影響：對其中3項研究[7， 15-16]的新鮮周期下IVF和ICSI對CHD風險的影響隊列研究進行異質性檢驗I=0%且P=0.99(>0.1)，表明納入的3項研究無異質性，采用固定效應模型。Meta分析結果如圖3，OR=2.07[95%CI(1.28，3.37)]且Z=2.94(P=0.003)，提示新鮮周期時ICSI組比IVF組子代有更高的CHD發(fā)生率，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。凍融周期方面，因為僅1項隊列研究[7]明確凍融周期來源，因此未進行分析。

3.IVF和ICSI對子代PDA發(fā)生的影響：對3篇涉及CHD中PDA類型的研究[10， 17-18]進行合并異質性檢驗I=0%且P>0.1，提示無異質性，用固定效應模型。Meta分析結果如圖4所示，OR=1.07[95%CI(0.57，2.04)且Z=0.22(P=0.83)，提示ICSI組與IVF組子代PDA患病率的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由于無新鮮周期，因此不對新鮮周期亞組進行分析。

4.IVF和ICSI對子代ASD發(fā)生的影響：有4篇涉及ICSI和IVF對子代ASD發(fā)生影響的隊列研究[7，10，17-18]，對其進行異質性檢驗I=6%且P=0.36(>0.1)表明無異質性，所以應用固定效應模型。Meta分析結果如圖5示，OR=0.97[95%CI(0.47，2.02)]且Z=0.08(P=0.93)，兩組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明ICSI組與IVF組比較，并沒有增加子代ASD發(fā)生風險。因僅1項研究[7]是新鮮周期移植，因此不做新鮮周期亞組分析。

圖3 新鮮周期下CHD發(fā)生率比較

圖4 PDA發(fā)生率比較

圖5 ASD發(fā)生率比較

5.IVF和ICSI對子代VSD發(fā)生的影響：有5篇研究涉及ICSI和IVF對子代VSD發(fā)生影響的隊列研究[7，10，13，17-18]，合并進行異質性檢驗I=0%且P=0.62(>0.1)表示無異質性，使用固定效應模型。Meta分析結果見圖6，OR=1.02[95%CI(0.53，1.96)]且Z=0.06(P=0.95)，兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示ICSI組與IVF組比較，并沒有增加VSD發(fā)生風險。由于僅1項研究[7]是新鮮周期移植，未做新鮮周期亞組分析。

6.IVF和ICSI對子代TOF發(fā)生的影響：有3篇涉及ICSI與IVF對子代TOF發(fā)生影響的隊列研究[7，10，18]，合并進行異質性檢驗I=13%且P=0.32(>0.1)表示無異質性，使用固定效應模型。Meta分析結果見圖7，OR=1.07[95%CI(0.28，4.15)且Z=0.10(P=0.92)，兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示ICSI與IVF相比，并不增加子代TOF發(fā)生風險。僅一項研究[7]是新鮮周期移植，未做新鮮周期亞組分析。

圖6 VSD發(fā)生率比較

圖7 TOF發(fā)生率比較

五、發(fā)表偏倚分析

采用RevMan5.2軟件繪制13項研究的漏斗圖。圖形顯示，左右對稱且呈倒漏斗形，提示不存在發(fā)表偏倚(圖8)。

圖8 以CHD發(fā)生率為基準的發(fā)表偏倚分析漏斗圖

討 論

本Meta分析納入了13項關于不同ART對CHD發(fā)生風險的隊列研究[6-18]，其中有5篇[7，10，13，17-18]涉及CHD不同種類的隊列研究，出生兒共63 147例。Meta分析提示ICSI和IVF兩種不同授精方對CHD發(fā)生的影響無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。由于FET對新生兒畸形率的影響目前存在爭議[22-23]。我們對新鮮周期的隊列研究進行了進一步的亞組分析，發(fā)現新鮮周期中ICSI組比IVF組子代CHD發(fā)生風險顯著提高(P<0.05)。這與Maheshwari等[24]的研究相似，胚胎冷凍復蘇可能會降低ART引起的子代出生缺陷風險。這可能是冷凍復蘇的過程本身就是對胚胎優(yōu)勝劣汰的選擇，可以篩選出好的胚胎移植[25]。雖然形態(tài)好的胚胎會優(yōu)先新鮮周期移植，但剩余的能耐受凍存的質量好的胚胎亦具有良好的發(fā)育潛能和著床能力，而質量差的胚胎則在冷凍復蘇過程中更易受到損害，影響后續(xù)著床，不能成功妊娠。

ICSI增加CHD風險可能與受精方式本身相關。與IVF相比，ICSI繞過了卵母細胞對精子自然選擇的屏障，可能會注入質量差的精子，將某種基因缺陷和高遺傳風險的基因傳給下一代[26-27]。并且ICSI對于卵母細胞是一種有創(chuàng)性操作，因此操作過程中可能存在對卵母細胞結構的機械性損傷和胞漿內環(huán)境的變化，干擾紡錘體或細胞的正常周期[28]。并且精子在ICSI過程中經過的各種檢測手段也可能導致傷害。多項研究發(fā)現ICSI后胚胎染色體異常、甲基化異常[29-30]和mRNA介導的基因表達異常[27]增多。ICSI治療后的男性后代出現Y染色體缺失及染色體核型異常發(fā)生率相對較高[26]，包括22q11.2缺失，18號染色體異常等。

但也研究認為ICSI與IVF這兩種授精方式本身對胚胎發(fā)育潛能的影響無顯著差異，配子的質量才是決定胚胎發(fā)育潛能，進而影響妊娠結局的重要因素[31]。與IVF的指征(包括女方因素和男方少弱精子癥)比較，ICSI主要適用于男性因素不育。無精子癥患者伴有較高的染色體微缺失[32]。男性不育患者的精子中也逐漸發(fā)現多種非編碼RNA的表達調控異常[33]。其后代伴有較高的染色體異常率[34]和印跡基因甲基化水平異常[30]。

而染色體改變和基因異常等遺傳因素是CHD的危險因素。22q11.2微缺失被認為與嚴重主動脈肺動脈側支動脈、PDA、肺動脈閉鎖和VSD等主要CHD發(fā)病有關[35]。GATA4等基因的突變、拷貝數變異、多態(tài)性和甲基化常都可引起心臟畸形[36-38]，其中心臟特異轉錄因子基因TBX5、GATA4等異常可導致如ASD、VSD、PDA、TOF、心內膜墊缺損及右心室發(fā)育不良等許多遺傳性和單發(fā)CHD[37]。多種miRNAs、cirRNAs和lncRNAs的表達調控異常也逐漸被發(fā)現與CHD相關[39-40]。ICSI有創(chuàng)的受精方式和配子較高的低質量率所帶來的胚胎染色體及基因異常率增加，可能與ICSI組子代較高的CHD發(fā)生率有關。

但是通過對4種常見CHD的亞組進行分析，我們發(fā)現ICSI組子代PDA、ASD、VSD及TOF的患病率并沒有顯著高于IVF組。由于對新鮮周期下不同CHD的研究較少，因此我們沒有對新鮮周期進行亞組分析。在沒有排除胚胎冷凍因素的影響下，我們不能肯定ICSI是否不會增加子代4種常見CHD風險，尚有待進一步研究。

目前對ICSI技術導致后代出生缺陷的遺傳突變的發(fā)生規(guī)律仍然知之甚少，故植入前遺傳學檢測十分重要。胚胎植入前非整倍體篩查(PGS)可在胚胎移植前對胚胎染色體結構及數量進行檢測和篩查，從而避免染色體相關的先天缺陷。有研究顯示ICSI后行PGS可明顯改善妊娠結局[41]。植入前遺傳學診斷(PGD)可通過微陣列技術(aCGH)和高通量測序等技術對單基因多態(tài)性和突變進行分析，對每條染色體的非整倍性進行評估，以選擇正常的胚胎移植，不僅可以避免染色體相關的先天缺陷，還可以避免心臟發(fā)育相關轉錄因子突變和單核苷酸多態(tài)性導致的單發(fā)型CHD[42]。另外，還有必要對精子進行相關基因篩查，提高精子質量，進而降低后代CHD發(fā)生的風險。

但本研究尚存在一些不足之處：(1)本研究所包含的各隊列研究中，存在兩種類型隊列研究，前瞻性的證據等級高于回顧性隊列研究，本次Meta分析由于文獻數量有限并未對此進行亞組分析，這在很大程度上影響了循證醫(yī)學結論的強度。(2)本次Meta分析所納入的資料均為公開發(fā)表，并可在全文中獲得完整數據的文獻，共計13篇，可能存在文獻收錄不全的問題。(3)Meta分析本身是一種觀察性研究而不是實驗研究，因此質控的標準因主觀因素不可能完全一致，這也是Meta分析固有的局限性。因此有待進一步開展調整匹配死產流產率、不孕不育病因、胚胎形態(tài)等因素的大樣本、多中心、長時間隨訪的ART對子代CHD影響的前瞻性隊列研究。