干擾BAG-1表達對黑素瘤B16F10細胞放射敏感性的影響

金德蕙 王占想 宋亞麗

惡性黑素瘤(malignant melanoma)是一種高度惡性的黑素細胞腫瘤，早期手術徹底切除后預后尚可，一旦發生轉移，對放療、化療均不敏感，5年生存率不超過14%。因此探討如何提高黑素瘤對放療、化療的敏感性，成為黑素瘤研究的熱點之一。

Bcl-2-associated athanogene 1(BAG-1)基因位于染色體9p12，其編碼蛋白BAG-1蛋白通過與多種靶分子結合，參與調節細胞生物學的多個環節。BAG-1蛋白主要通過其C末端與熱休克蛋白(HSP)70的肽結合區結合，促進細胞增殖；還可通過激活Raf-1信號通路調節細胞增殖；在細胞表面，BAG-1與酪氨酸激酶受體如干細胞生長因子HGF/血小板衍生生長因子PDGF受體結合能增強細胞對生長因子誘導的凋亡；在細胞漿內，可與Bcl-2結合以調節細胞凋亡；在細胞核內，可與多個核激素受體如維生素D3受體、維A酸受體結合而調節相應核激素的表達與活性[1-3]。

臨床研究發現BAG-1蛋白在正常組織幾乎不表達或低水平表達，而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高度表達。腫瘤細胞BAG-1基因表達上調可增強腫瘤細胞的抵抗轉移能力，增加對凋亡刺激及化療的耐藥性；而下調其表達則增加腫瘤細胞對凋亡刺激、化療的敏感性[1,2]。

一般認為黑素瘤對放療不敏感，但在某些特殊情況下放療仍是一項重要的治療手段。目前尚未見有關BAG-1對黑素瘤放射治療反應影響的相關文獻報道。本研究通過體外實驗探討RNA干擾黑素瘤B16F10細胞BAG-1基因表達對放射線X線的敏感性的影響，并進行細胞凋亡率檢測及相關機制探討。

1 材料和方法

1.1 細胞培養及試劑 黑素瘤B16F10、M14細胞株購自南京凱基公司， RMPI 1640培養基為Gibco公司產品，胎牛血清為杭州四季青公司產品，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司; 兔抗鼠BAG-1多克隆抗體 為Santa Cruz公司產品，兔抗鼠Caspase3、8、9、PARP一抗及聚合HRP標記羊抗兔IgG二抗(貨號BA1056)購自武漢博士德公司。

1.2 構建干擾質粒pGCsi-BAG-1并穩定轉染黑色素瘤細胞，檢測轉染效率 構建干擾質粒pGCsi-BAG-1[4]。脂質體Lipo2000轉染人黑素瘤細胞M14及鼠黑素瘤細胞B16F10，陰性對照組(NC-shRNA)黑素瘤細胞轉染插入無關序列的干擾載體。具體操作如下：轉染前一天，將人黑素瘤細胞M14及鼠黑素瘤細胞B16F10接種到6孔培養板上，接種密度(3～4)×105/mL。轉染時，細胞要達到90%～95%的融合。溶液1：按照無血清RMPI 1640培養基與lipofectamine 2000按照每孔240 μL∶10 μL比例混合，溫育5 min。溶液2：無血清RMPI 1640培養基與質粒按照每孔240 μL∶4 μg比例混合。將溶液1與溶液2混合，室溫下置20 min。6孔培養板中的細胞用無血清RMPI 1640培養基沖洗兩遍，加入2 mL無血清培養基。將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻，37℃、5% CO2中保溫5～6 h后更換含有血清的全培養基，培養24 h后，G418(600 μg/mL)篩選，獲得BAG-1表達沉默的B16F10細胞株，G418篩選后存活細胞擴增用于后續實驗，提取其RNA及蛋白，RT-PCR檢測BAG-1 mRNA變化，Western blot檢測BAG-1蛋白變化。

1.3 細胞放射敏感性試驗

1.3.1 克隆形成實驗檢測細胞放射敏感性 人胚腎上皮細胞HEK293的基因表達類似于神經系統細胞，對電離輻射較敏感，是輻射機制基礎研究的常用細胞株。本實驗以HEK293細胞作為對照，研究M14、B16F10細胞對X射線照射的敏感性。將HEK293、M14、B16F10細胞置于含10%胎牛血清的RMPI 1640培養基、5% CO2孵箱37℃孵育，2～3 d傳代1次。取指數生長期細胞株，用胰酶消化后制成單細胞懸液，培養24 h后美國Varian Trilogy醫用直線加速器照射。根據不同的X射線照射劑量將細胞接種于直徑為100 mm培養皿中，照射X射線0、1、2、4、6、8 Gy的每皿1000個細胞，6、8 Gy的每皿2000個細胞，每組設三個平行皿。照射24 h后細胞繼續培養14 d，至有克隆形成；倒去上清培養液，用PBS洗滌2次，加入75%甲醇固定液，鋪滿培養皿底面，固定5 min。棄去固定液，待稍干燥后加入0.5%結晶紫(甲醇配制)染色5 min，顯微鏡(低倍鏡)下檢查染色程度，當克隆著色足夠時用水洗去殘余染液，以每團細胞數>50個作為一個克隆計數，計算克隆形成率(克隆形成率=生成克隆數/接種細胞數×100%) 和存活分數(SF=受照射細胞的克隆形成率/對照細胞克隆形成率×100%)。描繪出的細胞存活曲線。

1.3.2 BAG-1基因沉默后黑素瘤細胞對放射線的敏感性 將未轉染的B16F10細胞(Control組)、陰性對照質粒轉染細胞(NC-shRNA組) 和穩定轉染BAG-1-shRNA的細胞(BAG-1-shRNA組)暴露于0、1、2、4、6、8Gy的 X 射線，于照射后24 h進行克隆形成實驗，比較細胞放射敏感性差異。

1.3.3 細胞凋亡檢測 流式細胞儀檢測細胞凋亡：將Control組、NC-shRNA組和BAG-1-shRNA組細胞濃度調整為5×106/mL，培養24 h后收集細胞。參照Annexin V/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒操作說明，流式細胞儀分析。在Annexin V高染而PI低染區域的細胞為早期凋亡細胞。

Western blotting檢測BAG-1沉默對黑素瘤細胞凋亡相關蛋白Caspase3、8、9、PARP表達的影響：提取Control組、NC-shRNA組和BAG-1-shRNA組細胞蛋白，SDS-PAGE電泳，電泳結束后按半干轉膜法轉膜(NC膜)，5%的脫脂奶粉中封閉2 h, 1∶1000稀釋一抗孵育，室溫下于搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min,加入1∶5000稀釋的二抗，室溫下，搖床孵育45～60 min,TBST洗膜3次，每次10 min，用LI-COR掃膜儀掃膜，紅外激光成像系統對待測蛋白進行分析。

2 結果

2.1 檢測干擾BAG-1表達效率 如圖1所示，與Control組相比，BAG-1-shRNA組BAG-1 mRNA和蛋白表達明顯降低,分別下降了68%、71%(P<0.05)。為驗證質粒的干擾效率，同時檢測了黑素瘤M14細胞轉染BAG-1-shRNA后BAG-1mRNA表達，顯示下降程度為70%，干擾效率類似于B16F10細胞。

2.2 黑素瘤細胞放射敏感性體外試驗

2.2.1 黑素瘤細胞放射敏感性檢測 見圖2。細胞存活曲線顯示人胚腎HEK293細胞對放射線較敏感，X線 8Gy劑量照射時存活率接近0，而黑素瘤細胞M14細胞和B16F10細胞的存活率分別為1.5%和1.9%(P<0.05)。

2.2.2 BAG-1基因沉默后黑素瘤細胞對放射線的敏感性 見圖3。BAG-1-shRNA組對X放射線敏感性增高，8 Gy照射存活率為0.32%，相比Control組1.9%，NC-shRNA組1.75%，存活率顯著降低(P<0.05)。

2.3 黑素瘤B16F10細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

2.3.1 細胞凋亡率測定 見圖4。Control黑素瘤B16F10細胞組在X線照射后凋亡率由2.5%升高至7.1%，在轉染BAG-1-shRNA聯合X線照射后，BAG-1-shRNA組的凋亡率達到25.3%， NC-shRNA組9.2%，差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 細胞凋亡相關蛋白檢測 見圖5。黑素瘤B16F10細胞BAG-1-shRNA組的pro-PARP、pro-Caspase 3等酶原蛋白較Control組和NC-shRNA組明顯下降(P<0.05)，凋亡蛋白c-PARP及細胞凋亡級聯蛋白c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9表達均較Control組和NC-shRNA組顯著增高(P<0.05)，尤其以c-PARP、c-Caspase 3的改變更為顯著。結果證實Caspase酶解級聯反應參與了BAG-1誘導的細胞凋亡調節過程。

圖1 a：黑素瘤B16F10細胞轉染BAG-1-shRNA組BAG-1mRNA表達下降了68%，M14細胞轉染BAG-1-shRNA組BAG-1mRNA表達下降了70%；b、c:B16F10細胞轉染BAG-1-shRNA組BAG-1蛋白表達下降了71%

圖2 不同X線照射劑量，人胚腎HEK293細胞和黑素瘤M14細胞、B16F10細胞的存活曲線圖3 不同X線照射劑量，黑素瘤B16F10細胞Control組、轉染NC-shRNA組、轉染BAG-1-shRNA組的細胞存活曲線圖4 流式細胞儀檢測黑素瘤B16F10細胞Control組、轉染NC-shRNA組、轉染BAG-1-shRNA組X線照射前、后的細胞凋亡率

圖5 Western blot法檢測黑素瘤B16F10細胞Control組、轉染NC-shRNA組、轉染BAG-1-shRNA組細胞凋亡蛋白c-PARP、c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9及其酶原pro-PARP、pro-Caspase 3的表達

3 討論

BAG-1蛋白是一種多功能蛋白，具有多種調節功能：(1)抑制細胞凋亡和應激反應；(2)調節細胞信號傳導；(3)影響轉錄活性；(4)參與調節蛋白質翻譯后修飾-重組/降解，影響細胞黏附、侵襲、轉移。干擾BAG-1表達可能通過抑制黑素瘤細胞增殖、促進黑素瘤細胞凋亡從而影響黑素瘤生物學行為及治療反應[3]。Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發的級聯反應是細胞凋亡過程的中心環節，BAG-1的過度表達能夠抑制Caspase的激活，從而能抑制諸如化學制劑、放射等誘導的凋亡[5]。因此，干擾BAG-1表達有可能通過促進黑素瘤細胞凋亡而發揮治療輔助效應。

黑素瘤本質上抵抗放療這一觀點最初源于細胞培養研究。臨床上，黑素瘤的輔助放療主要用于淋巴結清掃和某些頭頸部黑素瘤(尤其是鼻腔)的術后補充治療，可進一步提高局部控制率[6,7]。放射增敏是指為增強射線對腫瘤細胞的殺傷效應，提高腫瘤的控制率和治愈率，應用一些藥物或物理等方法來提高腫瘤細胞對射線的敏感性的過程[8]。

本研究顯示X放射線8 Gy劑量照射黑素瘤細胞M14細胞株和B16F10細胞株，其存活率分別為1.5%和1.9%，提示黑素瘤細胞對X放射線相對較抗拒。在RNA干擾BAG-1基因表達后，8 Gy劑量X線照射黑素瘤B16-F10細胞存活率為0.32%，提示RNA干擾BAG-1基因表達可顯著增高黑素瘤細胞對X放射線的敏感性，即具有放射增敏功能。

流式細胞儀檢測顯示黑素瘤B16F10細胞在X線照射后凋亡率為7.1%， 在干擾BAG-1基因表達聯合X線照射后其凋亡率則高達25.3%，差異顯著。進一步研究發現RNA 干擾BAG-1基因表達可顯著增高黑素瘤B16F10細胞c-PARP、c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9等細胞凋亡相關蛋白的水平，提示促進細胞凋亡可能是干擾BAG-1基因表達所致放射增敏功能的機制之一。干擾黑素瘤細胞BAG-1表達促進細胞凋亡的具體機制有待進一步研究證實。

本研究提示干擾黑素瘤細胞RNA基因表達可能通過促進細胞凋亡發揮放射增敏功能，研究為臨床黑素瘤治療提供新的治療靶位和治療思路。