二氫楊梅素對APAP誘導小鼠急性肝損傷的保護作用

屠夢玨，魏進歌，陳 鑫,2，王玉琴

(1. 南通大學藥學院，江蘇 南通 226001；2. 鹽城市第一人民醫院藥劑科，江蘇 鹽城 224005)

肝臟是機體重要的新陳代謝和解毒器官，容易被一些化學物質如酒精、四氯化碳和對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)損傷[1-2]，導致肝細胞壞死和肝功能障礙。APAP是一種常用的非處方藥，在治療劑量下是安全的，但越來越多的臨床試驗和實驗動物研究證實，APAP過量可引起急性肝衰竭[3]。治療劑量時，APAP主要在肝臟被葡萄醛酸化和硫酸化，代謝為無毒的水溶性代謝產物，只有極少部分APAP被代謝成為有毒性的活性產物N-乙酰-對苯醌亞胺(N-acetyl-q-benzoquinone imine，NAQPI )。 NAQPI可以與谷胱甘肽(glutathione，GSH)結合，形成APAP-谷胱甘肽、APAP-半胱氨酸和APAP-N-乙酰半胱氨酸來解毒。但是，當APAP過量導致NAQPI產生過多，繼而耗竭細胞內GSH后，剩余的NAPQI 可以共價結合細胞生物大分子形成NAQPI-蛋白質加合物，導致氧化應激反應，線粒體功能障礙和細胞核DNA斷裂，最終導致肝細胞壞死和肝損傷[4]。

臨床上對于APAP過量導致肝損傷的治療，除了N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)之外，目前亦無其他有效藥物。二氫楊梅素(dihydromyricetin， DHM)，3,5,7,3′,4′,5′-六羥基2,3-二氫黃酮醇，又名蛇葡萄素，是一種重要的黃酮醇化合物，來源廣泛，存在于葡萄科、楊梅科、藤黃科、柳科等植物中，在藤茶屬植物中含量最高。DHM具有多種藥理學活性，如抗炎、抗氧化、護肝、抑制腫瘤細胞增殖、調節脂質及血糖代謝等[5]。既往研究發現，DHM能夠抑制由氨基半乳糖誘導的大鼠乳酸脫氫酶、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)水平的升高，具有較好的肝保護作用。DHM體外對于小鼠肝臟谷胱甘肽-S-轉移酶有抑制作用[6]，體內能夠升高乙醇誘導小鼠肝損傷模型肝臟還原性胱甘肽水平，降低肝臟丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平，通過清除氧自由基、提高肝細胞的抗氧化能力，對乙醇性肝損傷具有明顯的保護作用[7]。本實驗研究預防性給予DHM對APAP誘導的小鼠急性肝損傷的影響，并探討了其可能的作用機制。若能證實DHM干預對于APAP損傷的肝臟有保護效應，則可能為其實際應用于臨床提供實驗室證據。

1 材料

1.1藥物與試劑DHM(西安自然生物技術有限公司，批號161106,純度>98%)；APAP(Abcam公司，Lot.APN12278-1-1, 純度>98%)；雙環醇片(bicyclol，批號170205, 北京協和藥廠)；ALT、AST、GSH、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及MDA檢測試劑盒(南京建成生物有限公司)；p-JNK、JNK、Bax一抗(CST公司)；α-tubulin一抗、抗兔及抗鼠二抗(Proteintech公司)；活性氧(reactive oxygen species, ROS)熒光探針-DHE(北京威格拉斯生物技術有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒、SYBR GREEN(TaKaRa公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMSF和RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所)。

1.2實驗動物SPF級C57BL/6小鼠，♂，6周齡，體質量18～22 g，購買并飼養于南通大學實驗動物中心，自由飲食，動物合格證編號：SCXK(蘇)2012-0031。實驗嚴格按照國家和南通大學實驗動物中心動物使用管理條例進行。

1.3儀器PowerWaveX340型全自動酶標儀(美國Bio-Tek公司)；電泳、轉膜及化學發光成像系統(Bio-Rad公司)；ABI7500熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)；冰凍切片機(Leica公司)；OLYMPUS DP72熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1實驗動物分組及給藥24只C57BL/6小鼠，自由飲食，適應性飼養1周后，隨機分為對照組(Control)、模型組(Model)、DHM 300 mg·kg-1組、陽性對照藥雙環醇200 mg·kg-1組(bicyclol 200 mg·kg-1)，每組6只。按體質量10 mL·kg-1灌胃給藥，每天1次，對照組與模型組每天灌胃等體積生理鹽水，連續7 d。末次給藥禁食(不禁水)24 h后，除對照組外，每組小鼠腹腔注射300 mg·kg-1APAP生理鹽水溶液(10 mL·kg-1)[3-4]；對照組給予相同體積生理鹽水腹腔注射。APAP腹腔注射4 h后，眼眶后靜脈叢取血，處死小鼠。生理鹽水灌注心臟后取肝臟組織，部分經4%多聚甲醛固定，用于組織病理學檢測，另一部分組織-80℃保存備用。

2.2小鼠血清ALT和AST水平檢測各組小鼠眼眶后靜脈叢取血，室溫靜置30 min后，血液凝固，3 000 r·min-1離心10 min，取上清，-80℃保存備用。按照試劑盒說明書操作，酶標儀于不同波長處測定吸光度值，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

2.3小鼠肝臟ROS熒光探針-DHE染色新鮮切取小鼠肝臟，用OCT冰凍切片包埋劑包埋后，迅速冷凍固定，切片。用稀釋到合適濃度的ROS熒光探針室溫避光孵育1 h，PBS清洗后滴加防淬滅劑封片。通過熒光顯微鏡觀察，拍照。

2.4小鼠肝臟組織中GSH、MDA含量及SOD活力測定取約100 mg小鼠肝臟組織塊，加入9倍體積的生理鹽水，在冰浴中勻漿后，4℃、2 500 r·min-1離心15 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取勻漿上清液0.1 mL，加0.1 mL試劑一混勻，4℃、3 500 r·min-1離心10 min，按照試劑盒說明書操作，測定吸光度值，計算樣品濃度。

2.5實時熒光定量PCR法檢測小鼠肝組織IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達取100 mg肝組織勻漿，TRIzol法提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒，按照說明書進行反轉錄，隨后采用20 μL反應體系通過熒光定量PCR儀進行擴增。所用引物序列如下：IL-6：(Forward)5′-UCCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA-3′，(Reverse)5′-CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTC-3′；TNF-α：(Forward)5′-CACCATGAGCACAGAAAGCA-3′，(Reverse)5′-TAGACAGAAGAGCGTGGTGG-3′；IL-1β：(Forward)5′-ACTCATTGTGGCTGTGGAGA-3′，(Reverse)5′-TTGTTCATCTCGGAGCCTGT-3′；GAPDH：(Forward)5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，(Reverse)5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。以GAPDH為內參基因，采用2-△△Ct計算目的基因相對表達量。

2.6Westernblot檢測小鼠肝臟組織中Bax、p-JNK及JNK蛋白表達取100 mg肝組織，加入1 mL預冷的RIPA裂解液，勻漿后提取總蛋白，用BCA法定量。每組取40 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜法轉膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應一抗，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應二抗室溫孵育2 h，ECL發光，化學發光成像系統掃描，Image J軟件測定條帶灰度值，以目的條帶和內參比值用于統計分析。

3 結果

3.1DHM預處理減輕了APAP誘導的小鼠急性肝損傷血清ALT和AST水平反映了小鼠肝細胞的損傷程度。與正常對照組相比，在經APAP處理后，模型組小鼠血清ALT和AST水平明顯升高(P<0.01)，說明APAP腹腔注射誘導小鼠急性肝損傷造模成功。與模型組相比，DHM和陽性對照藥雙環醇可以明顯抑制APAP誘導的AST水平增加(P<0.05)；對于升高的ALT水平，DHM和雙環醇也有一定抑制效應，但差異無統計學意義(Fig 1A、1B)。進一步通過HE染色觀察小鼠肝組織損傷情況，如Fig 1C所示，模型組小鼠肝臟出現大量空泡狀肝細胞和炎性細胞浸潤；預先給予小鼠DHM和雙環醇能明顯減少空泡狀肝細胞數量，并減少了炎性細胞在局部病灶的聚集、浸潤。同時，各組小鼠肝臟指數無明顯差異(Fig 1D)。

Fig 1 Pretreatment of DHM alleviated APAP-induced acute liver injury in Serum AST(A) and ALT(B), histopathologic examination(C,×200) and liver ratio of weight(D) were used for the measurement of liver injury.##P<0.01 vs control group;*P<0.05 vs model group

3.2DHM預處理降低了APAP小鼠肝組織MDA及ROS水平MDA反映了組織的脂質過氧化水平，由Fig 2A可知，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織MDA水平明顯升高(P<0.05)，提示模型組小鼠存在明顯的氧化應激損傷。進一步對小鼠肝臟冰凍切片進行ROS熒光探針-DHE染色，如Fig 2B所示，模型組小鼠肝臟熒光強度明顯增加，說明組織中ROS水平較高。預先給予小鼠DHM能明顯降低肝組織MDA水平(P<0.05)，明顯減弱組織熒光強度。提示DHM對于APAP肝損傷的保護作用可能與減少ROS產生、減輕氧化應激有關。

3.3DHM預處理升高了小鼠肝組織GSH水平及SOD活力APAP過量時產生大量具有高度親電子活性的中間產物NAPQI，消耗胞內GSH。當80%～90% GSH被消耗后，過多的NAPQI就會和肝細胞蛋白共價結合形成半胱氨酸加和物，進而導致細胞的氧化應激反應、線粒體損傷等胞內過程，最終導致細胞死亡。如Fig 3所示，APAP模型組GSH水平明顯降低(P<0.01)，說明肝細胞內GSH被消耗，而DHM和雙環醇能抑制這種消耗(P<0.05)，對肝細胞起保護作用。此外，SOD活力反映了細胞對自由基的清除能力，APAP明顯降低了小鼠肝組織中SOD活力(P<0.01)，而DHM組和雙環醇組SOD活力較模型組明顯升高(P<0.05)。這些結果提示，DHM可通過增加GSH水平和SOD活力來保護受到APAP損傷的肝細胞。

3.4DHM預處理降低了小鼠肝組織炎癥相關因子IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA水平如Fig 4所示，與對照組相比，模型組小鼠肝臟IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA水平均明顯升高(P<0.01)；DHM和雙環醇均可以降低模型組肝臟中升高的IL-6、TNF-α mRNA水平(P<0.05)，對升高的IL-1β mRNA水平也有抑制作用，但差異無統計學意義。結果提示，DHM和雙環醇可減輕APAP引起的炎癥反應。

Fig 2 Pretreatment of DHM decreased levels of MDA(A)and ROS(B) in liver of APAP-treated

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group

4 討論

APAP作為臨床上應用廣泛的解熱鎮痛抗炎藥，大劑量或長期服用可能會造成肝損傷。本實驗采用APAP誘導的小鼠急性肝損傷模型，觀察DHM預防性干預對受損肝組織的效應，并推測其可能的作用機制。

Fig 3 Pretreatment of DHM increased GSH level(A) andSOD activity(B) in liver of APAP-treated

Fig 4 Pretreatment of DHM decreased mRNA levels of IL-6,TNF-α and IL-1β in liver of APAP-treated

APAP主要在肝臟進行代謝，正常情況下，大多數迅速被葡萄糖醛酸化或被硫酸化，轉化為無毒性代謝產物[7-9]；過量則大量消耗GSH，形成半胱氨酸加合物，引發嚴重的氧化應激反應、線粒體損傷、激酶通路激活等[10]，最終引起肝細胞死亡。在本文中，模型組小鼠因過量APAP作用而導致肝組織GSH水平明顯降低，氧化應激損傷明顯，這些結果都與之前文獻報道一致；而DHM干預能明顯升高小鼠肝組織GSH水平及SOD活力，緩解由過量APAP導致的氧化應激損害。這些證據表明，DHM對于肝細胞的保護作用可能與其具有較強抗氧化作用，并能提高細胞內GSH水平有關。

Fig 5 Pretreatment of DHM decreased JNK phosphorylation andBax protein expression in liver of APAP-treated

據報道，除了氧化應激之外，APAP肝毒性與炎癥反應也密切相關。APAP代謝產物亦會導致肝臟枯否細胞活化，炎癥細胞浸潤和大量炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-6等產生，引發了炎癥反應[11]。炎癥反應募集炎性細胞至肝臟，進一步促進產生大量有毒性的ROS，加重氧化應激損傷。在本實驗中，APAP模型組小鼠肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA水平較對照組明顯升高，DHM干預能明顯降低升高的炎癥相關因子mRNA水平，提示其對肝臟的保護作用除了與抗氧化作用有關之外，亦與其具有抗炎作用相關。

嚴重氧化應激會導致JNK途徑的激活，并引起JNK磷酸化水平增高，并將JNK轉移到線粒體[12]。JNK遷移到線粒體能明顯增強線粒體氧化應激，刺激線粒體功能障礙和開孔[13]，線粒體膜蛋白如細胞凋亡因子和內切核酸酶G的泄漏，直接攻擊DNA，最終導致細胞DNA裂解和細胞死亡[14]。在本實驗中，我們觀察到APAP模型組JNK磷酸化蛋白的明顯增高，DHM對這種APAP誘導的磷酸化升高有抑制效應。JNK磷酸化和氧化應激同時也激活許多不同的細胞凋亡相關的Bcl-2家族蛋白，主要包括Bax蛋白等[15]。Bax是一個促凋亡因子，被激活表達增加后，會促使細胞凋亡發生。Western blot法檢測肝組織中Bax蛋白表達，發現在APAP模型組中其表達明顯升高，而DHM的干預能夠降低Bax蛋白表達水平。結合之前實驗結果，提示DHM對于APAP損傷小鼠肝臟的保護作用是綜合了其抗炎、抗氧化、抑制JNK信號通路的激活以及肝細胞凋亡的結果。

綜上所述， DHM在APAP誘導小鼠肝損傷模型中發揮抗炎和抗氧化應激作用，進而抑制JNK信號通路的激活，并抑制肝細胞凋亡，保護了APAP損傷的小鼠肝臟。本實驗結果為DHM及其相關產品用于藥物性肝損傷的預防和治療提供了實驗依據。

(致謝：本實驗在南通大學藥學院藥理學教研室及南通大學實驗動物中心完成，衷心感謝各位老師的支持和幫助。)