川芎平喘合劑對COPD相關肺動脈高壓大鼠NO、ET-1的影響*

郭曉燕，錢家驊，徐向前，范春香，張惠勇

上海中醫藥大學附屬龍華醫院肺病科，上海 200032

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的重要并發癥，是COPD發展至慢性肺源性心臟病的重要病理生理過程，肺動脈壓(PAP)持續升高，可致右心負荷增加，最終發生右心衰竭，是影響COPD患者疾病進程的獨立危險因素［1］。近年研究顯示，COPD肺組織缺氧，肺血管功能受損，在內皮細胞合成、分泌的一氧化氮(NO)、內皮素1(ET-1)失衡，導致肺血管收縮增強、舒張減弱，引起PAH。本研究擬通過建立COPD相關肺動脈高壓模型，探討川芎平喘合劑對大鼠肺動脈壓的作用及對NO、ET-1的影響，揭示川芎平喘合劑的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠60只，清潔級，體質量(200±20)g，購自上海斯萊克動物實驗中心，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物合格證號：SCXK(滬)2014-008。所有大鼠在同一動物房中飼養，溫度(25±l)℃，濕度28%的環境中適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 實驗藥物 川芎平喘合劑，藥物組成：川芎12 g，赤芍18 g，白芍 18 g，當歸 9 g，丹參 9 g，黃荊子9 g，胡頹葉 18 g，細辛 5 g，辛夷 5 g，生甘草6 g，取上述藥物制成液體制劑，其終濃度為每毫升含生藥量為1.526 g(1.526 g/mL)，由上海中醫藥大學附屬龍華醫院制劑室提供。將川芎平喘合劑根據成人日服劑量，通過公式 D1∶D2=R1∶R2，按動物體表面積比率換算等效劑量，其中D：劑量，R：體表面積。計算出大鼠日服量：9.81 g/(kg·d)。鹽酸法舒地爾注射液(天津紅日藥業有限公司規格，2 mL∶30 mg)。

1.3 主要試劑與儀器 自制有機玻璃煙薰箱(60cm×40 cm×80 cm)；中南海牌香煙(焦油含量10 mg/支)；氣體濃度檢測儀(河南中安電子探測技術有限公司)；RM6240型多道生理信號采集系統(成都儀器廠)；酶標儀(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo)；電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)；離心機型號(上海安亭科學儀器廠)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；ET-1 ELISA試劑盒(美國Phoenix)；NO酶法試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.4 模型制備 參照許滸、蔣明等［2-3］復制COPD相關肺動脈高壓動物模型。采用煙熏聯合脂多糖復制COPD模型，將大鼠放入自制有機玻璃艙，第1、14 天氣道內注入脂多糖(LPS)200 μg，每天艙內煙熏4次共2小時(15支/次，30 min/次，第1、14天除外)，連續6周，從第5周開始，艙內煙熏同時疊加每天吸入18%低氧8小時，每周6天，連續2周。

1.5 分組與給藥 將SD大鼠按隨機數字表法隨機分為4組，分別為：對照組、模型組、川芎平喘合劑組、法舒地爾組，每組15只。各組均從第7周即造模成功后給予藥物治療，川芎平喘合劑組給予川芎平喘合劑9.81 g/(kg·d)灌胃，法舒地爾30 mg/(kg·d)腹腔注射，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，持續2周。

1.6 觀察指標

1.6.1 肺動脈壓 參照孫波等［4］檢測方法，行

右心導管術測大鼠肺動脈壓。用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，頸部正中作長約1.5 cm的縱行切口，并游離右頸外靜脈約1 cm，結扎，剪口，用一充盈肝素溶液的聚乙烯管經頸靜脈緩慢插管至右心房、右心室及肺動脈，導管另一端連接壓力傳感器至Medlab生物信號采集系統，根據壓力波形確定導管位置，記錄平均肺動脈壓力(mPAP)。

1.6.2 右心指數 測定肺動脈壓力結束后，立即完整取出心臟和肺臟，分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+S)，并依次稱重，計算右心肥大指數(RVHI)=RV/(LV+S)。

1.6.3 NO、ET-1 各組大鼠肺動脈壓力測定結束，腹主動脈取血5 mL，3 000 r/min離心15分鐘，取上清液-80℃保存。采用硝酸還原酶法測定NO，酶聯免疫吸附法測定ET-1。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件分析數據，計量資料以(±s)表示，符合正態分布采用單因素方差分析，不符合正態分布則采用非參數檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 平均肺動脈壓 模型組mPAP高于對照組(P＜0.05)，法舒地爾、川芎平喘合劑組mPAP均較模型組下降(P＜0.05)，川芎平喘合劑組與法舒地爾組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠平均肺動脈壓比較(±s) mmHg

表1 各組大鼠平均肺動脈壓比較(±s) mmHg

注：與對照組相比＊表示P＜0.05，＊＊表示P＜0.01；與模型組相比，#表示P＜0.05

組別 只數 平均肺動脈壓對照組 15 25.05±2.74模型組 15 33.08±3.32＊＊川芎平喘合劑組 15 29.67±2.42＊#法舒地爾組 15 29.18±2.37＊#

2.2 右心指數 模型組、川芎平喘合劑組大鼠RVHI高于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，川芎平喘合劑組、法舒地爾組大鼠右心指數與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，川芎平喘合劑組與法舒地爾組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表 2。

表2 各組大鼠右心指數比較(±s)

表2 各組大鼠右心指數比較(±s)

注：與對照組比較，＊P＜0.05，＊＊ 表示 P＜0.01

RV/g LV+S/g RVHI組別/%對照組 0.26±0.09 1.45±0.32 0.19±0.08模型組 0.34±0.04 1.26±0.21 0.28±0.06＊川芎平喘合劑組 0.32±0.29 1.19±0.17 0.27±0.11＊法舒地爾組 0.29±0.11 1.18±0.15 0.26±0.12

2.3 NO、ET-1水平 與對照組比較，模型組大鼠NO水平降低，ET-1水平升高(P＜0.05)。川芎平喘合劑組、法舒地爾組均較模型組NO升高，ET-1水平降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)，川芎平喘合劑組與法舒地爾組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表 3。

表3 各組大鼠NO、ET-1水平比較(±s)

表3 各組大鼠NO、ET-1水平比較(±s)

組別 NO/(μmol·mL-1) ET-1/(pg·mL-1)對照組 66.65±8.25 132.62±26.00模型組 33.89±5.57＊＊ 251.06±41.25＊＊川芎平喘合劑組 47.56±10.08## 216.04±24.00##法舒地爾組 43.67±9.33# 214.70±28.64#

注：與對照組比較，＊＊P＜0.05，＊＊ 表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##P＜0.01

3 討論

根據COPD相關PAH、肺心病的臨床表現，多將其歸于“咳嗽”“肺脹”“喘證”等范疇。早期病變首先在肺，因肺臟反復受邪，外邪侵襲，肺失宣降，宣降失司，氣機阻閉，痰濁內蘊，壅阻氣道，肺氣上逆而致咳嗽、咯痰、喘息、胸悶等不適，后期久咳久喘致喘悸不寧，心氣、心陽虛衰，心脈瘀阻，則肺病及心。早期以痰濁為主，漸而痰瘀互見，終至痰濁、血瘀錯雜為患，痰瘀阻肺是發病的主要病理機制。

川芎平喘合劑由全國名老中醫邵長榮教授結合多年臨床經驗研制，具有活血化瘀、止咳平喘等作用。本研究結果表明，模型組大鼠肺動脈壓升高，右心指數升高，川芎平喘合劑組、法舒地爾組肺動脈壓較模型組下降，右心指數有下降趨勢，表明川芎平喘合劑能降低COPD相關PAH大鼠肺動脈壓力。現代研究顯示，川芎有效成分川芎嗪能夠恢復動態平衡，并將血管的通透性降低，改善缺氧狀態，保護肺血管［5］；赤、白芍成分芍藥苷具有抗凝血、擴血管作用［6］；胡頹子葉乙酸乙酯、正丁醇提取物有鎮咳、平喘、祛痰作用［7］；當歸對PAH有作用，并可降低右室肥厚［8］。NO是體內發現的第一個氣體信號分子，是由內皮細胞產生、分泌的血管舒張因子，與可溶性鳥苷酸環化酶結合，提高cGMP水平，舒張肺血管，抑制平滑肌收縮，降低肺動脈壓力，維持肺循環穩定［9］。適量的NO能舒張血管，抑制平滑肌細胞增殖，當過量表達時，可與Hb結合形成亞硝酸巰基醇化合物，損傷肺組織細胞，導致PAH升高［10］。合并PAH的COPD患者肺動脈內源性NO產生減少，NO水平降低，使生長因子表達增加，促進肺血管細胞增生，表現為肺動脈內膜增厚、中層肥厚，肺血管收縮［11］，是PAH產生的重要因素。Mealy MA等［12］研究證實，NO吸入療法能迅速降低PAH，但是對于NO吸入治療濃度尚缺乏統一標準。適量濃度吸入NO可降低新生兒PAH，對患者凝血機制無明顯影響。ET-1由血管內皮細胞合成、分泌，分泌增加可持續收縮血管，促進肺血管平滑肌增殖，是PAH發病的關鍵物質［13］。COPD合并PAH的患者呼出氣中冷凝液和(或)血循環中ET-1水平升高，而且呼出氣冷凝液或動脈中ET-1濃度與肺動脈收縮壓或平均壓顯著相關［14］。陳建麗等［15］研究顯示，COPD合并PAH患者血清ET-1高于正常組及無PAH的COPD患者，且ET-1與肺動脈壓呈正相關，提示ET-1在COPD繼發性PAH形成機制中起重要作用。同時，PAH刺激ET-1生成增多，清除減少，ET-1促進PAH的形成和發展，二者相互影響，互為因果。本研究結果表明NO與ET-1在COPD相關PAH發病中具有顯著作用，川芎平喘合劑組可降低COPD相關PAH中ET-1水平，升高NO水平，調節肺動脈血管的舒張與收縮，降低肺動脈壓力。