豬冷凍精液在規模化豬場的應用探索

陳獻欣，蘭 云，李暉仁，唐一波，吳細波，凌 宏，張灼源

（1．廣西農墾永新畜牧集團有限公司良圻原種豬場， 廣西 橫縣 530317；2．崇左市畜牧站， 廣西 崇左 532200）

人工授精技術起源于1780年意大利科學家Spallanzani，其通過對比格犬進行人工授精并取得成功[1]。而應用于豬的人工授精技術的探索則始于20世紀30年代。1956年，Ploge在他的《豬人工授精》一書中，描述了源于20世紀30年代前蘇聯國營農場所探索、應用的包括采精、精液稀釋和輸精等相關的豬人工授精技術，論述豬人工授精可以使得高質量公豬得以更廣泛的應用，低風險、低成本地引入新的遺傳物質，實用且不引入疾病等優點[2]。但由于受限于當時的保存、稀釋、配送網絡、輸精工具等條件，直到20世紀60至80年代，豬人工授精技術才得以大范圍的推廣，并在歐洲、亞洲等地迅速普及。我國豬人工授精技術于20世紀90年代開始被廣大養殖企業和養殖戶所接受和應用推廣。目前國內養豬行業采用人工授精技術對母豬進行授精的比例，在集約化的大中型種豬場中這一比例超過95%。豬人工授精技術的普及，加快了優秀公豬遺傳物質的推廣，提高生產效率，取得了很高的經濟效益。但是優秀公豬精液的長期保存、運輸、遺傳物質的國際間交流等問題依然是一系列難題，阻礙養豬行業的快速發展。

隨著科研人員的深入研究，人工授精技術又取得新的進展，即豬冷凍精液技術：利用干冰（-79 ℃）、液氮（-196 ℃）、液氦（-269 ℃）等作冷卻源，將精液特殊處理后冷凍，保存在超低溫的液氮（-196 ℃）狀態下，達到長期保存的目的，并且解凍后能夠使精子達到輸精的要求。世界許多科學家在精液冷凍液配方的篩選、提高解凍后精子的活率和頂體完整率等方面進行了較多研究，豬冷凍精液的應用才得以在生產實踐中推廣開來。1976年，廣東省農業科學院畜牧繁殖所經過4年的努力，完成了豬冷凍精液的制作、稀釋、配種、分娩等一系列試驗，對國內豬冷凍精液的研究打下了堅實的基礎[3]。

豬冷凍精液技術具有長期保存精液，不受時間、地域的限制開展省際、國家之間的優秀種豬的遺傳物質交流，進行后裔測定后選擇優良種豬，降低血緣更新、引種等生產成本等方面的巨大優勢。但是也存在解凍后精液質量不佳，繁殖成績不穩定，生產成本高，應用設備條件要求高，受輸精環境影響大等一系列的問題。并且國際上較多的冷凍精液供應企業對豬精液的稀釋、冷凍、解凍等條件都不一致，導致行業內缺乏通用的冷凍精液使用規程，豬冷凍精液應用效果評估也較少。為了更好地開展育種工作，提高遺傳進展，廣西農墾永新畜牧集團有限公司良圻原種豬場開展了一系列加裕公司豬冷凍精液的應用研究，為規模化豬場的豬冷凍精液應用提供參考依據。

1 試驗設計

1.1 材料與方法

1．1．1 試驗材料及設備

1）豬冷凍精液：由加拿大加裕公司進口；

2）試驗動物：廣西農墾永新畜牧集團有限公司良圻原種豬場3～5胎齡新美系大白、長白、杜洛克種母豬；

3）設備及耗材：液氮儲存罐、長臂手套、凍精稀釋粉、去離子水、80 mL深部輸精瓶、燒杯若干、恒溫水浴鍋、3 L容量保溫杯、計時器、長鉗子或大鑷子、紙巾、剪刀、紅外線溫度探測儀、磁力攪拌器、移液器等。

1．1．2 試驗地點和時間

1）試驗地點：廣西農墾永新畜牧集團有限公司良圻原種豬場第二種豬場（傳統飼養方式）、第四種豬場（全程空氣過濾模式）；

2）試驗時間：2016年6月9日—2016年12月18日；2016年9月10日—2017年1月22日。

1.2 試驗設計及操作規范

在第二原種豬場選擇約50頭健康的正常發情的3～5胎齡經產母豬（新美系大白、長白）進行純繁，在第四原種豬場選擇約100頭健康的正常發情的3～5胎齡經產母豬（新美系大白、長白、杜洛克）進行純繁，按照生產批次陸續開展豬冷凍精液的人工授精，基礎日糧與其余母豬相同。每頭母豬配種2次，妊娠30 d時B超檢查受胎情況，母豬分娩時記錄產仔總數、健仔數、畸形數、死胎數、木乃伊胎等。觀察豬群健康狀況、采食情況、糞便情況等，保持圈舍通風、衛生、干燥，日常飼養管理和免疫消毒程序、疾病的治療與防治按豬場常規方法進行。發現返情、空胎豬只時記錄時間，并在試驗記錄中做好標識。

同期使用鮮精進行常規人工授精并純繁的母豬，設為對照組。

1.3 豬冷凍精液的解凍及稀釋

1）從液氮中取出1～2支冷凍精液麥管（0．5 mL/ 支），立即轉入 38℃水浴鍋中解凍；

2）將麥管在 38℃下解凍 20 s，立即取出冷凍精液，解凍時間不能過長，否則易導致精子死亡；

3）用干凈面巾紙擦干冷凍精液麥管外部；

4）晃動精液麥管將氣泡移至將要開口的一端(上端)；

5）豎直麥管，用剪刀剪開上端，避免精液與剪刀的接觸；

6）倒轉麥管于事先預熱至26℃的精液管，剪開精液管另一端棉塞，將精液從吸管倒入精液瓶中。8支冷凍精液為一個輸精頭份，最終獲得精液精子數量為每劑40億精子；

7）緩慢加入預熱至26℃解凍稀釋劑 60 mL ；

8）封好輸精瓶備用，運輸至配種舍時不能劇烈搖晃；

9）解凍稀釋液配制：把50 g Androhep?CryoGaurd ?-Thaw粉劑溶解于1 L預溫至26℃的去離子水中，讓酸堿度(pH)穩定后(1 h)再作為稀釋劑。不能將剩余的稀釋劑冰凍后再使用。如果使用不足1 000 mL時，可按照配制比例1 g溶解于20 mL去離子水中進行配制。

1.4 凍精品質的檢測

將凍精解凍后孵育10 min后取10 uL樣品于預熱至37℃的載玻片上，加蓋玻片用精子分析儀觀測精子活力和快速直線運動精子比例，選擇活力≥20%的精液進行輸精試驗。

1.5 使用解凍的精液進行授精及注意事項

1)由于解凍后精子的活力比鮮精有較大程度的下降，精液應在解凍后20 min 內使用 ；

2)配種母豬應選擇斷奶后4～6 d正常發情的3～5胎經產母豬，在發情后24 h、36 h各輸精一次，異常發情、返情的母豬不宜用冷凍精液配種；

3)后備母豬最佳效果在第3次發情期，發情后12 h、24 h各輸精一次；4)使用冷凍精液配種時必須采用子宮頸深部輸精法。

1.6 統計指標

使用KFnets軟件記錄每頭母豬的與配公豬、配種時間、B超妊檢結果，分娩時間、分娩結果等。

1.7 數據處理及統計分析

數據采用SPSS 22．0軟件進行統計分析，與對照組母豬繁殖情況進行比較。結果以平均數±標準差表示，其中P＜0．05表示差異顯著，P＜0．01表示差異極顯著。

2 試驗結果與分析

2.1 第二種豬場試驗結果

由表1可知：第二種豬場在6月9日—7月15日，場內總計配種511頭，其中豬冷凍精液人工授精51頭，純繁配種頭數95頭，配二元雜365頭。凍精的精子在37℃下復蘇3～5 min后鏡檢活力在0．44±0．22，常規輸精的精子活力 0．82±0．11。純繁的繁殖成績為受胎率92．71%，分娩率 86．46%，冷凍精液配種母豬的繁殖成績為受胎率52．94%，分娩率49．02%。卡方檢驗表明，冷凍精液配種母豬的受胎率、分娩率等均與同期的純繁相比差異極顯著，冷凍精液配種只有常規人工授精成績的57%左右。

由表2可知：第二種豬場豬冷凍精液窩均產仔總數9．12頭、活仔數7．48頭，本場同期純繁窩均產仔總數11．86頭、活仔數10．05頭。冷凍精液配種母豬的產仔總數、活仔數等均與同期的純繁相比差異極顯著，冷凍精液配種只有常規人工授精成績的74%～76%左右。活仔率兩者差異不顯著，但是凍精組仍比常規組少2．7個百分點。

由表3可知：豬冷凍精液組出生窩重、斷奶窩重、斷奶均頭重、哺乳仔豬成活率等成績分別為 11．79k g、50．17 kg、7．6 kg、92．74%， 本 場 同期 純 繁 成 績 為 13．71 kg、60．79 kg、6．85 kg、90．55%。冷凍精液配種母豬的出生窩重、斷奶窩重等比同期的純繁成績低14%～18%，但是冷凍精液組哺乳仔豬斷奶均頭重比同期的純繁成績高0．75 kg/頭，成活率比同期的純繁成績高2．2%，可能是冷凍精液組帶仔數少于對照組所導致。公母豬比例中母豬數凍精組比常規組高24%。

2.2 第四種豬場試驗結果

由表4可知：第四種豬場在2016年9月10日—2017年1月22日，場內總計配種1 301頭，其中豬冷凍精液人工授精99頭，全部種豬都是純繁配種。凍精的精子在37℃下復蘇3～5 min后鏡檢活力在0．58±0．18，常規輸精的精子活力0．77±0．17。常規配種的繁殖成績為受胎率89．95%，分娩率85．44%，冷凍精液配種母豬的繁殖成績為受胎率76．05%，分娩率69．70%。卡方檢驗表明，冷凍精液配種母豬的受胎率、分娩率等均與同期的純繁相比差異極顯著，冷凍精液配種只有常規人工授精成績的82%～84%左右。第四種豬場豬冷凍精液組窩均產仔總數9．74頭、活仔數7．81頭，本場同期純繁窩均產仔總數12．09頭、活仔數9．72頭（含杜洛克）。冷凍精液配種母豬的窩均產仔總數、健仔數、出生窩重等均與同期的純繁相比差異極顯著，冷凍精液配種只有常規人工授精成績的80%～82%左右，差異極顯著；活仔率均在80%左右，差異不顯著。

3 討論

豬的冷凍精液技術是人工授精的一項重大的變革，對開展聯合育種、加快遺傳進展、提高優秀種豬的利用率有著重大意義。但是這一新技術的現實應用還存在不少亟待解決的難題：一是豬精液的冷凍工藝還需要改進。國內外較多報道顯示，冷凍精液的稀釋液與冷凍保護劑的配制、降溫速度、精液的包裝方法等有著不同的方式與方法，解凍后精液的質量也參差不齊。二是豬冷凍精液的解凍方法沒有進行有效的統一。權凱[4]等直接將5 mL/袋的豬袋裝冷凍精液從液氮中取出，用剪刀剪開兩端后投入到40℃盛有BTS常溫保存液的50 mL豬一次性輸精瓶中，在40℃水浴下搖動至完全溶解，解凍后，活率均在0．4以上、死精子比例為59%～74%、頂體完整率58．7%～71．6%、有效存活時間為 50～ 80 min；張渭斌[5]等從液氮罐中取出2～3支0．5 mL/支的細管迅速投入38℃水浴鍋中解凍30 s，用干凈的紙擦干細管，剪開細管將精液倒入預熱至26℃的集精瓶中，然后緩慢加入預熱至26℃的解凍液，邊加邊搖，先按1：1體積比進行低倍稀釋，40 s后再加至所需量，活力最高的達到（42．4±0．9）%，質膜完整率為（47．2±0．3）%，頂體完整率為（46．8±0．4）%。三是進行輸精試驗的母豬數量少，且結論不一致。權凱等采用三個品種（長白、大約克夏、杜洛克）合計121頭正常發情的母豬進行冷凍精液輸精試驗，情期妊娠率為90．2%、窩產仔數10．6頭、活仔率95．7%，與液態保存豬精液的人工授精結果無顯著性差異（P＞0．05）；夏天等[6]經液氮儲存的豬精液在52℃水溫下解凍12 s，解凍活力在0．3級以上，輸精6頭母豬，產仔55頭，平均9．16頭，活仔53頭，平均8．82頭，低于常規鮮精配種；張渭斌等研究結果表明冷凍精液平均妊娠率為 72%，產仔數為（6．64±0．82）頭，顯著低于常規鮮精水平。

表1 冷凍精液配種母豬配種受胎情況

表2 冷凍精液配種母豬分娩情況

表3 冷凍精液配種母豬產仔生長性能情況

表4 冷凍精液配種母豬配種受胎情況

試驗在第二種豬場開展時，冷凍精液組受胎率、分娩率分別是常規鮮精組的 57．11%、56．70%，總產仔 9．12頭，健仔7．48頭，是常規鮮精組的76．90%、74．43%。第四種豬場開展時，冷凍精液配種母豬的繁殖成績為受胎率76．05%，分娩率69．70%，常規配種的繁殖成績為受胎率89．95%，分娩率85．44%，冷凍精液試驗組是常規鮮精組的84．55%、81．58%；冷凍精液組窩均產仔總數9．74頭、活仔數7．81頭，本場同期純繁窩均產仔總數12．09頭、活仔數9．72頭（含杜洛克），試驗組是常規鮮精組的 80．58%、80．37%。

兩組試驗結果差異的原因可能有以下幾個方面：

1）冷凍精液的解凍稀釋過程有差異。第二種豬場精液解凍稀釋實驗室距離儲存冷凍精液的液氮罐距離約1 km，采用保溫杯將冷凍豬精麥管運至實驗室的途中會受到高溫天氣的影響，導致精液質量下降，精子死亡；第四種豬場精液解凍稀釋直接在全環境控制、空氣過濾的種公豬站中進行，減免掉運輸豬精的外部環境干擾因素；

2）配種時間不同。第二種豬場精液解凍后配種時間在夏季早上8：30、下午6：00以后；第四種豬場精液解凍后配種時間在秋冬季早上7：30、下午5：30以后。配種季節不同與配種時間的提前，環境溫度適宜，能夠減少由于廣西夏季氣溫高對母豬產生的應激。

3）環境控制不同。第二種豬場未采用全環境控制，較第四種豬場先進的空氣過濾系統有一定的差距，母豬配種后適宜的環境有利于受精卵的著床。

4 結論

試驗研究表明，冷凍精液配種母豬的受胎率、分娩率是常規鮮精組的57%、75%左右，產仔總數、健仔數是常規鮮精組的75%、80%左右。豬冷凍精液的保存、運輸、配種時間以及豬場的環境控制工藝、生物安全體系模式，會影響到豬冷凍精液的繁殖成績。如何縮小豬冷凍精液與常規鮮精輸精的差距，在規模化豬場推廣豬冷凍精液配種技術，還需要進一步地開展研究。