PPARγ激動劑吡格列酮對胰島素抵抗大鼠冠狀動脈脂聯素受體表達的影響

沈絮華，邱 惠，梁思文，李虹偉

（首都醫科大學附屬北京友誼醫院 心血管中心，北京 100050）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是心血管 疾病尤其是動脈粥樣硬化性疾病的一個重要危險因素[1]。目前認為脂肪組織不僅是儲能器官，同時也是重要的內分泌器官，脂肪細胞分泌的脂肪因子是代謝綜合征與心血管疾病之間的重要橋梁。脂聯素（adiponectin，APN）是近年發現的由脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白，在肥胖相關的代謝綜合征以及多種心血管疾病中起保護作用。臨床研究發現，肥胖、2型糖尿病、胰島素抵抗、血脂代謝異常、冠心病和高血壓患者的血清脂聯素水平降低，血循環中高脂聯素水平可以使2型糖尿病的危險性降低，而且脂聯素與血糖和胰島素水平負相關。

吡格列酮（pioglitazone，PIO）作為人工合成的高度選擇性過氧化物酶增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-gamma，PPAR-γ）配體，通過激活核轉錄因子PPAR-γ調節與糖代謝相關的多種基因表達[2]。已有研究表明，PPARγ可調控不同組織細胞脂聯素及其受體的表達合成[3，4]。目前關于PPARγ調控脂聯素受體的研究主要集中在脂肪組織細胞，肝臟組織細胞、骨骼肌細胞和巨噬細胞，但PPARγ是否能調控胰島素抵抗時冠狀動脈內的脂聯素受體表達尚不清楚。本研究以高果糖飲食并使用小劑量STZ誘導的胰島素抵抗大鼠為胰島素抵抗動物模型，比較胰島素抵抗大鼠冠狀動脈中脂聯素受體表達變化以及與炎性因子的關系，探討PPARγ激動劑吡格列酮對冠狀動脈脂聯素及其受體影響。

1 資料與方法

1.1 胰島素抵抗大鼠模型的建立和分組

應用上述雄性SD大鼠30只，選擇6只為普通飲食組（normal pellet diet，NPD），予普通大鼠飼料喂養4周，其余24只大鼠按下列方法建立胰島素抵抗大鼠模型：參照Reaven等[5]的方法予高果糖飼料喂養，喂養4周后，禁食12h后給予后腹腔內注射鏈脲佐菌素（STZ）25mg/kg。1周后，禁食12h進行尾靜脈抽血，測定空腹血糖濃度（fasting blood glucose，FBG）、放射免疫法測定空腹血清胰島素濃度（fasting serum insulin，FSI），并計算胰島素敏感指數 （insulin sensitive index，ISI），ISI=-In（FBG×FSI），ISI≤-4.88 說明造模成功[6]。 共 16 只大鼠造模成功。實驗第5周，普通飲食組大鼠，生理鹽水灌胃4周（NPD組）；造模成功的胰島素抵抗大鼠6只，生理鹽水灌胃4周（IR組）；造模成功的胰島素抵抗大鼠6只，吡格列酮灌胃4周（PIO組），吡格列酮采用10mg/Kg/d。

1.2 體重、血壓測量

測量3組大鼠喂養9周后的體重。應用尾動脈血壓儀測量各組喂養9周后的收縮壓。

1.3 血清學檢測

實驗第9周末，使各組大鼠空腹過夜，次日上午空腹采血置于EP管，3000rpm/min離心10min，分離血清，置于-80℃冰箱保存。應用東芝全自動生化分析儀和酶法測定各組大鼠的FBG、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG），應用 ELISA 方法測量血清FSI，脂聯素水平，并計算膜島素敏感指數 （ISI）。

1.4 RT-PCR

實驗第9周末，使各組大鼠空腹過夜，麻醉下心臟取血處死，在倒置顯微鏡下，利用顯微剪迅速分離大鼠冠狀動脈，置于液氮中保存。每只大鼠分離兩支冠狀動脈，分別用于RT-PCR和Western Blot。

冠脈組織液氮研磨，按50～100mg組織/ml Trizol加入Trizol，提取RNA，立即進行逆轉錄，逆轉錄條件 70℃ 加熱 5min，42℃保溫 60min，95℃加熱 5min，4℃ 1～5min。 采用 RT-PCR法測定 3組冠脈中 AdipoR1、AdipoR2和 TNF-ɑ的 mRNA表達。參考相關文獻應用primer 5程序設計引物序列[7]，所有引物由Invitrogen公司合成。基因的引物序列如下：AdipoR1引物序列：上游引物：5’-CCTGGGACTTGGCTTGAGT-3’，下游引物：5’-GGAATCCGAGCAGCATAAA-3’，擴增片段長度153bp；AdipoR2 引物序列： 上游引物：5’-ACGAATGGAAGAGTTTGTTTG-3’，下游引物：5’-GGCGAAACATATAAAAGATCC-3’，擴增片段長度 242bp；TNF-ɑ引物序列： 上游引物：5’-GAACAACCCTACGAGCACCT-3’，下 游 引 物 ：5’ -GGGTAGTTTGGCTGGGATAA-3’，擴增片段長度112bp；GAPDH 引物序列：上游引物：5’-CCTGCCAAGTATGATGACATCAAG-3’，下游引物：5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’，擴增片段長度 75bp。PCR 反應條件：94℃預變性 5min，94℃變性 30s，60℃退火 60s，共 49 循環。

1.5 Western Blot

按照蛋白質提取，測定各樣品濃度。SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，轉膜，封閉，一抗孵育，加入抗體稀釋液稀釋的Adipo R1（1：1000稀釋）/Adipo R2 （1：1000 稀釋）/TNF-琢 （1：500 稀釋）/GAPDH抗體（1：1000稀釋），室溫搖床上溫育2h，進行酶標二抗孵育，避光條件下，將膜置于NBT/BCIP顯色液工作液中，顯色至條帶清晰，經IPP6.0圖像分析軟件測定圖片上各條帶灰度值，目的蛋白的灰度值除以內參GAPDH的灰度值以校正誤差。

表1 整體實驗各組生物學指標

1.6 統計學方法

計量資料采用單因素方差分析并進行組間比較，計數資料用χ2檢驗。

2 結果

2.1 3組大鼠生物學指標的比較

至實驗第9周末，IR組和PIO組大鼠體重顯著高于 NPD 組（514±61g，526±37g vs.476±41g，P＜0.05），IR 組和 PIO 組的 FBG （9.78±2.65mmol/L，8.94±1.66mmol/L vs.5.49±0.58mmol/L，P＜0.01）和FSI（179.3 ±19.5pmol/L，152.2 ±25.2pmol/L vs.127.5±16.0pmol/L，P＜0.01） 與 NPD 組相比顯著升高，PIO組的FSI較RI組顯著下降 （P＜0.01）。與NPD組相比，ISI在PIO組較IR組顯著下降 （P=0.012）。與NPD組相比，其他2組TG水平較NPD組顯著增高 （207.84±23.84mg/dl，158±25.53mg/dl vs.46.3±3.23mg/dl，P＜0.01），PIO 組甘油三脂水平較IR組降低（P＜0.05）。PIO組的總膽固醇水平與IR組無顯著性差異（P＞0.05）。IR組血清脂聯素水平較 NPD組明顯降低 （9.04±0.87ug/ml vs.12.6±1.26ug/ml，P＜0.01），PIO 組脂聯素水平較 IR 組顯著增高（P＜0.05），見表1。

表2 吡格列酮對血壓的影響

2.2 4組大鼠血壓的比較

表2示，至實驗第9周末，IR組和PIO組大鼠的收縮壓、平均動脈壓和舒張壓均顯著高于NPD組（P＜0.05）。IR組與PIO組大鼠之間血壓無顯著性差異。

2.3 RT-PCR

至實驗第9周末，IR組冠狀動脈中的AdipoR1 mRNA、AdipoR2 mRNA的表達均顯著低于NPD組 （均P＜0.01），后2組冠狀動脈AdipoR1 mRNA、AdipoR2 mRNA的表達較IR組均顯著增高 （P＜0.01），IR 組冠狀動脈中的 TNF-ɑ mRNA的表達顯著高于NPD組 （P＜0.01），PIO組冠狀動脈TNF-ɑ mRNA的表達較 IR組顯著降低 （P＜0.01）。 見圖1。

圖1 實驗第9周各組mRNA的表達（**：與NPD組比較，P＜0.01；## 與IR組比較，P＜0.01。）

表3 實驗第9周末3組大鼠冠狀動脈AdipoR1、AdipoR2蛋白的表達

2.4 Western Blot

表3示，各組大鼠冠狀動脈AdipoR1、AdipoR2、TNF-α蛋白的表達。至實驗第9周末，與NPD組大鼠相比，IR組大鼠冠狀動脈AdipoR1、AdipoR2蛋白的表達均顯著降低 （均P＜0.01），冠狀動脈TNF-α蛋白的表達顯著增高（P＜0.01）。與IR組大鼠相比，PIO組大鼠冠狀動脈AdipoR1蛋白的表達顯著增高 （P＜0.01），PIO組大鼠冠狀動脈AdipoR2蛋白的表達顯著增高 （P＜0.05），PIO組冠狀動脈TNF-α蛋白的表達顯著降低 （P＜0.05）。

3 討論

1998年，美國學者Reaven把以IR為核心的各種疾病總稱為胰島素抵抗綜合征，又被稱為代謝綜合征，目前胰島素抵抗的產生機制尚未完全清楚，而作用于胰島素信號傳導途徑的各種病理改變均可誘導胰島素抵抗的發生。有研究發現，游離脂肪酸（FFA）、TNF-α、瘦素、抵抗素、纖溶酶原激活物抑制劑 1（plasminogen activator inhibitor type 1）、 白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、IL-10、 粘連蛋白-4（retinol binding protein-4）和脂聯素等與胰島素抵抗密切相關[8～10]，PPARγ的調節也是胰島素抵抗和心血管疾病的重要機制[11]。

目前對胰島素抵抗的研究仍以動物實驗為主要方法，而胰島素抵抗動物模型的復制方法一般分為3種，即遺傳型、膳食誘導型和藥物誘導型。本研究應用高果糖飲食誘導并使用小劑量STZ的胰島素抵抗SD大鼠作為胰島素抵抗模型，其FBG、FSI迅速增高，ISI迅速下降。

脂聯素受體是介導脂聯素生物學作用的關鍵蛋白。至今為止，3種脂聯素受體有能力與脂聯素結合，包括脂聯素受體 1和 2（AdipoR1，AdipoR2），以及T-鈣黏素。本研究結果顯示，應用Western Blot方法于各組大鼠冠狀動脈組織均可檢測到脂聯素受體AdipoR1和AdipoR2的蛋白表達，且于胰島素抵抗時大鼠冠狀動脈AdipoR1、AdipoR2蛋白的表達顯著下降。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR） 是一種核受體，激活后調控靶基因轉錄[12]。吡格列酮是人工合成的PPARγ高親和性配體，可降低胰島素抵抗，改善糖代謝。其主要作用機理為與PPAR的γ異構體結合，激活該受體，增強胰島素對肝細胞生糖的抑制作用，增強胰島素對肌細胞攝取外周血糖的促進作用，從而改善其血糖水平。PPARγ激活劑影響脂聯素分泌的機制是：PPARγ經內源性或者外源性的PPARγ配體活化后，與視黃醇類X受體 （RXR）結合成為異二聚體，再通過與特異DNA上的PPARγ反應元件（PPRE）結合來調節許多靶基因的轉錄。Iwaki等[13]發現人類脂聯素基因的啟動子中包含了PPRE的位點（-273～-285），同時發現PPARγ激活劑可以誘導脂聯素的啟動子的活性升高5～10倍。本研究發現吡格列酮顯著提高了胰島素抵抗導致的AdipoR蛋白和mRNA表達的下降，增加了血清脂聯素的水平。

內源性細胞因子可抑制脂聯素表達，血漿脂聯素水平與白細胞介素（IL）-6和TNF-α呈明顯負相關，TNF-α和脂聯素間可能通過旁分泌和自分泌方式相互作用。在巨噬細胞和所有單核細胞衍生的細胞中，APN可以增加抗炎細胞因子IL10、IL-1 受體（IL-1RA）的表達，減少脂多糖和TNF-α的表達[14]。本研究結果顯示，在整體實驗中，與NPD大鼠相比，胰島素抵抗大鼠冠狀動脈TNF-α蛋白的表達明顯增高，吡格列酮可以改善胰島素抵抗大鼠冠狀動脈中炎性因子的表達。

胰島素抵抗大鼠冠狀動脈AdipoR1、AdipoR2 mRNA和蛋白的表達降低，冠狀動脈TNF-α mRNA和蛋白的表達增高。PPARγ激動劑-吡格列酮能增加胰島素抵抗大鼠血清脂聯素水平，減輕高糖引起的冠狀動脈脂聯素受體表達的下降，抑制高糖導致的TNF-α的表達，并起到改善其糖脂代謝、增加胰島素敏感性和抗炎作用。