急性冠脈綜合征患者血清骨髓相關(guān)蛋白水平、外周血單個核細(xì)胞Toll樣受體4表達(dá)情況及其相關(guān)性研究

劉貴京，施海法，張素華，王曉利，范曉飛，康美玉，呼金田，燕 霞

動脈粥樣硬化以動脈壁炎性改變?yōu)橹饕卣鳎渲醒仔苑磻?yīng)不僅在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中發(fā)揮重要作用，還影響斑塊穩(wěn)定性［1］。骨髓相關(guān)蛋白（myeloid related proteins，MRP）是鈣結(jié)合蛋白S100家族成員，主要通過鈣離子依賴性方式形成特殊的異二聚體MRP8/MRP14而發(fā)揮作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，MRP8/MRP14蛋白復(fù)合體能作為特異性配體與Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，刺激單核細(xì)胞分泌炎性因子，引發(fā)一系列炎性反應(yīng)，進(jìn)而參與冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊形成［2-3］。Toll樣受體（TLRs）是一類模式識別受體，可介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)，是連接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁。既往研究結(jié)果顯示，TLR4是與動脈粥樣硬化關(guān)系最為密切的TLRs之一，其主要通過識別內(nèi)源性和外源性分子而啟動炎性反應(yīng)［4］。本研究旨在探討急性冠脈綜合征（ACS）患者血清MRP水平、外周血單個核細(xì)胞TLR4表達(dá)情況及其相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年3月—2016年3月河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科收治的ACS患者50例，均經(jīng)冠狀動脈造影確診，其中急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）25例（AMI組）、不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）25例（UAP組）；另選取同期穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）患者20例作為SAP組，體檢健康者24例作為對照組。4組受試者年齡、男性比例、體質(zhì)指數(shù)（BMI）及吸煙率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1），具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并急性感染、惡性腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病者；（2）合并嚴(yán)重肝、腎功能障礙者；（3）近1周內(nèi)有創(chuàng)傷史或手術(shù)史者。本研究經(jīng)河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有受試者知情。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 血壓、血糖相關(guān)指標(biāo)及血脂指標(biāo) 常規(guī)測量4組受試者收縮壓、舒張壓，采用全自動生化分析儀（西門子Siemens公司生產(chǎn)，型號：ADVIA 2400）檢測4組受試者空腹血糖、糖化血紅蛋白（HbA1c）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）及低密度脂蛋白（LDL）。

表1 4組受試者一般資料比較Table1 Comparison of general information in the four groups

1.2.2 血清MRP水平 采集4組受試者靜脈血2 ml，2 000 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），留取血清并置于-75 ℃冰箱中保存待測，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清MRP水平。

1.2.3 外周血單個核細(xì)胞TLR4表達(dá)情況 采集4組受試者靜脈血2 ml，采用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝處理，在Ficoll密度梯度離心管中制備外周血單個核細(xì)胞。以5×106個細(xì)胞/ml濃度將細(xì)胞重懸于Stain Buffer（pH值為7.4的磷酸緩沖液+2%小牛血清+0.1%疊氮鈉），采用固定液和破膜液處理，后1 000 r/min離心5 min（離心半徑8 cm），棄上清；采用3 ml Stain Buffer清洗細(xì)胞3遍，將細(xì)胞重懸于Stain Buffer，使細(xì)胞終濃度為10×106個細(xì)胞/ml。取100 μl細(xì)胞懸液（10×106個細(xì)胞/ml）置于BD試管中，加入5 μl PE標(biāo)記鼠抗人TLR4單抗（美國BD公司生產(chǎn)）混勻后室溫避光孵育60 min。采用3 ml Stain Buffer清洗細(xì)胞1遍，細(xì)胞沉淀用500 ml Stain Buffer重懸后上流式細(xì)胞儀（美國 BD公司）檢測外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；計數(shù)資料分析采用χ2檢驗；血清MRP水平與ACS患者外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血壓、血糖相關(guān)指標(biāo)及血脂指標(biāo) 4組受試者舒張壓、空腹血糖、HbA1c、HDL及LDL比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。4組受試者收縮壓及TG比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；UAP組和AMI組患者收縮壓及TG高于對照組和SAP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 血清MRP水平和外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率4組受試者血清MRP水平和外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；UAP組和AMI組患者血清MRP水平和外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率高于對照組和SAP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組與SAP組、UAP組與AMI組受試者血清MRP水平和外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

2.3 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清MRP水平與ACS患者外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率呈正相關(guān)（r=0.796，P＜0.01）。

表3 4組受試者血清MRP水平和外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率比較（）Table3 Comparison of serum MRP level and PBMC TLR4 positive rate in the four groups

表3 4組受試者血清MRP水平和外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率比較（）Table3 Comparison of serum MRP level and PBMC TLR4 positive rate in the four groups

注：MRP=骨髓相關(guān)蛋白，TLR4=Toll樣受體4；與對照組比較，aP＜0.05；與SAP組比較，bP＜0.05

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表2 4組受試者血壓、血糖相關(guān)指標(biāo)及血脂指標(biāo)比較（）Table2 Comparison of blood pressure，blood glucose related index and blood lipid index in the four groups

表2 4組受試者血壓、血糖相關(guān)指標(biāo)及血脂指標(biāo)比較（）Table2 Comparison of blood pressure，blood glucose related index and blood lipid index in the four groups

注：HbA1c=糖化血紅蛋白，TG=三酰甘油，HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白；與對照組比較，aP＜0.05；與SAP組比較，bP＜0.05

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3 討論

ACS是冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊破裂導(dǎo)致不同程度血栓形成引起的血管狹窄或閉塞，其發(fā)生機制較為復(fù)雜［5］。近年來研究表明，免疫炎性反應(yīng)在斑塊易損性方面具有重要作用［6-7］。MRP又稱為鈣衛(wèi)蛋白，是由MRP8和MRP14組成的異二聚體，其主要表達(dá)于有核細(xì)胞，是巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志物。既往研究表明，巨噬細(xì)胞激活后MRP8和MRP14迅速結(jié)合形成MRP8/MRP14異二聚體，進(jìn)而改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜位置，加速其分泌［8-9］。MRP8/MRP14具有廣泛的生物學(xué)功能，能被特異性地分泌至炎性病灶處，進(jìn)而參與炎性反應(yīng)［10］。既往研究表明，MRP能通過損傷內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白和連接蛋白而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂；此外，其還能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血小板反應(yīng)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)血小板黏附和血栓形成，進(jìn)而參與動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊形成［11］。近年研究發(fā)現(xiàn)，MRP8/MRP14可作為TLR4特異性配體而參與炎性反應(yīng)［4］。LOSER等［12］研究表明，MRP8/MRP14激活TLR4炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)，并通過FAT/CD36依賴機制釋放炎性因子，進(jìn)而參與炎性反應(yīng)。YONEKAWA等［13］研究發(fā)現(xiàn)，MRP8/MRP14作為特異性配體與TLR4結(jié)合，刺激單核細(xì)胞分泌炎性因子并引發(fā)一系列炎性反應(yīng)，進(jìn)而參與冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊形成。TLRs是介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的模式識別受體，在炎癥和免疫應(yīng)答過程中具有重要作用。截至目前，TLRs 13個家族成員中TLR4與心血管疾病關(guān)系最為密切。TLR4可導(dǎo)致核因子κB（NF-κB）激活，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）等炎性因子釋放并啟動炎性應(yīng)答［14］。

本研究結(jié)果顯示，UAP組和AMI組患者血清MRP水平高于對照組和SAP組，提示ACS患者血清MRP水平升高；但對照組與SAP組、UAP組與AMI組受試者血清MRP水平間無差異，推測MRP可能是導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的重要因素之一。本研究結(jié)果還顯示，UAP組和AMI組患者外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率高于SAP組和對照組，提示ACS患者外周血單個核細(xì)胞TLR4表達(dá)升高；但對照組與SAP組、UAP組與AMI組受試者外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率間無差異，推測外周血單個核細(xì)胞TLR4表達(dá)可能是導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的重要因素之一。進(jìn)一步分析血清MRP水平與外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率關(guān)系發(fā)現(xiàn)，血清MRP水平與ACS患者外周血單個核細(xì)胞TLR4陽性率呈正相關(guān)，提示MRP可能通過激活TLR4而參與ACS的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，ACS患者血清MRP水平及外周血單個核細(xì)胞TLR4表達(dá)升高，且二者呈正相關(guān)，推測MRP可能通過激活TLR4而參與ACS的發(fā)生、發(fā)展，這可能為ACS的研究及治療提供新的思路。但本研究為單中心研究，樣本量較小，且研究結(jié)果受現(xiàn)有醫(yī)療設(shè)備及技術(shù)水平影響，故存在一定局限性。

作者貢獻(xiàn)：劉貴京進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；施海法、張素華、康美玉、呼金田進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；燕霞進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；王曉利、范曉飛負(fù)責(zé)撰寫論文。

本文無利益沖突。