木犀草素對黑素瘤細胞增殖、侵襲、凋亡及血管內皮生長因子表達的影響

付銀鋒 康文娣

1河南省中醫院健康體檢中心（鄭州 450002）；2河南中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科（鄭州 450000）

皮膚惡性黑素瘤（cutaneous malignant melano?ma，CMM）是一種起源于黑色素細胞的惡性腫瘤，具有易轉移、轉移早、侵襲性強、病死率高等特點。目前，CMM的臨床治療手段有限，治療極具難度［1-2］。因此，尋找一種安全性高、療效好、副作用小的抗黑素瘤藥物迫在眉睫［3］。木犀草素是一種天然的四羥基黃酮化合物，廣泛存在于多種蔬菜和藥用植物中，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑制血管生成等多種藥理活性［4-6］。目前研究表明，木犀草素在結腸癌［7］、乳腺癌［8］、膠質母細胞瘤［9］等多種腫瘤中發揮重要的抑癌作用，包括抑制癌細胞增殖、轉移，并誘導癌細胞凋亡等。但木犀草素在CMM中的作用還不清楚。黑色素瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡及血管內皮生長因子（endothelial growth factor，VEGF）表達與CMM的發展進程密切相關。因此，本研究通過探討木犀草素對黑素瘤細胞系A375和B16F10的增殖、侵襲、凋亡及VEGF表達的作用及其分子調控機制，從而確定木犀草素在CMM發展中的作用，為木犀草素治療CMM提供理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞培養及藥物處理A375和B16F10細胞（美國ATCC），用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基在細胞培養箱中培養。當細胞生長至密度約為80%～90%時，將細胞分別接種于不同孔徑的孔板中，待細胞生長至密度約為70%～80%時，進行不同劑量（20、40、60 μmol/L）的木犀草素處理。

1.2實驗分組將A375和B16F10細胞分別分為4組：對照組、木犀草素20 μmol/L組、木犀草素40 μmol/L組、木犀草素60 μmol/L組。

1.3CCK?8檢測將對數期細胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設4個復孔。在木犀草素處理0、24、48、72 h時分別進行CCK?8檢測。每孔加入100 μL含10%CCK?8試劑的無血清RPMI 1640培養基，培養箱內繼續培養1 h，然后用酶標儀檢測450 nm波長下的OD值。

1.4Transwell實驗細胞貼壁后進行60 μmol/L的木犀草素處理，24 h后消化收集細胞，PBS洗滌3次，更換無血清培養基，調整細胞密度為5×105/mL。在預鋪有matrigel膠的Millicell insert上室中加入200 μL細胞懸液，下室中加入含10%FBS的RPMI 1640培養基，共培養24 h后，取出上室，棉簽擦去上室的殘留細胞，90%酒精常溫固定30 min，0.1%結晶紫常溫染色10 min。倒置顯微鏡照相并計數。

1.5流式細胞儀檢測將對數期細胞以2×105/孔的密度接種于6孔板，每組設4個復孔。在60 μmol/L的木犀草素處理48 h時，每孔分別加入5 μL An?nexin V?FITC 和 5 μL PI試劑，輕輕搖勻后閉光孵育15 min，于1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.6Western blot將對數期細胞以2×104/孔接種于24孔板，當60 μmol/L的木犀草素處理48 h后進行Western Blot檢測。用RIPA裂解液（含PMSF）裂解細胞，離心收集上清，然后用BCA試劑盒進行蛋白定量。通過SDS?PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后通過半干轉方法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。隨后經5%脫脂奶粉封閉后，加入Bcl?2（1∶500）、Bax（1∶500）、Caspase?3（1∶500）、VEGF（1∶1000）、p?Akt（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p?mTOR（1∶1000）和mTOR（1∶1000）等一抗4℃孵育過夜。然后加入相應二抗（1∶10000）室溫孵育1 h，Odys?sey紅外激光成像系統進行掃描。GAPDH表達量作為內參。

1.7RT?PCR將對數期細胞以2×104/孔接種于24孔板，當60 μmol/L的木犀草素處理48 h后進行RT?PCR檢測。用Trizol試劑提取細胞RNA，用紫外分光光度計定量。根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板檢測VEGF的mRNA水平。反應程序如下：94℃，5 min；變性 94℃，30 s；退火57℃，30 s；延伸72℃，30 s；40個循環。以β?actin 作為內參，采用 2?△△Ct法比較分析mRNA水平。

1.8統計學方法采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析，計量資料數據均采用x±s表示，單因素方差分析各組間的差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1木犀草素抑制黑素瘤細胞的增殖如圖1A所示，與對照組 HEK293T 細胞相比，20、40、60 μmol/L木犀草素處理72 h對HEK293T細胞的增殖活力無顯著影響，說明這3個濃度的木犀草素對正常細胞沒有生長抑制作用，無細胞毒性。與對照組相比，20、40、60 μmol/L木犀草素處理能夠顯著抑制A375和B16F10細胞的增殖，而且抑制效果具有藥物濃度和時間依賴性，木犀草素濃度越高，處理時間越長，增殖抑制效果越明顯（圖1B、1C），所以后續實驗選擇60 μmol/L木犀草素處理48 h為處理條件。

2.2木犀草素促進黑素瘤細胞的凋亡如圖2A、2B所示，與對照組相比，60 μmol/L木犀草素處理48 h后，A375和B16F10細胞的凋亡率顯著提高。如圖2C、2D所示，與對照組相比，木犀草素60 μmol/L組Bcl?2的蛋白表達顯著下調，而Bax和Caspase?3的表達顯著上調。

2.3木犀草素抑制黑素瘤細胞的侵襲通過Transwell實驗對細胞的侵襲能力進行檢測發現，在A375和B16F10兩種細胞系中，與對照組相比，木犀草素60 μmol/L組侵襲的細胞數目顯著減少（圖3）。

2.4木犀草素抑制黑素瘤細胞中VEGF的表達如圖4所示，在A375和B16F10兩種細胞系中，與對照組相比，木犀草素60 μmol/L組VEGF的mRNA和蛋白表達顯著降低。

2.5木犀草素抑制PI3K?Akt?mTOR信號通路如圖5所示，在A375和B16F10兩種細胞系中，與對照組相比，木犀草素60 μmol/L組p?Akt和p?mTOR的蛋白表達水平下降，差異有統計學意義，而Akt和mTOR的蛋白表達差異無統計學意義。

3 討論

木犀草素是一種具有多種藥理活性的天然黃酮化合物，在多種癌癥中都有顯著的抗癌作用［10］。本研究首次探討了木犀草素在黑素瘤細胞A375和B16F10中是否也發揮抗腫瘤作用，旨在為CMM的治療提供新的方向和依據。

凋亡是細胞主動發生地程序化死亡，與腫瘤的發生密切相關，是腫瘤發生的重要機制。研究發現，木犀草素能夠通過抗增殖和誘導凋亡來抑制惡性腫瘤細胞的生長［11］。因此筆者通過CCK?8檢測細胞增殖，發現木犀草素可以顯著抑制A375和B16F10細胞的增殖，且抑制效果呈濃度、時間依賴性。流式細胞儀檢測結果表明，木犀草素能夠誘導A375和B16F10細胞的凋亡。有文獻表明，木犀草素能夠通過內源性途徑，包括增加Caspase?3水平，以及提高Bax/Bcl?2表達比例，來誘導胃癌細胞凋亡［12］。與該研究結果一致，本研究發現與對照組相比，木犀草素組的Bcl?2蛋白水平明顯下調，而Bax和cleaved?Caspase?3的表達明顯上調。以上研究結果說明，木犀草素能夠通過抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡來發揮抗黑素瘤作用。

圖3 木犀草素對A375和B16F10細胞侵襲的影響Fig.3 Effect of luteolin on the invasionof A375 and B16F10 cells

圖4 木犀草素對A375和B16F10細胞中VEGF表達的影響Fig.4 Effect of luteolin on the VEGF expression in A375 and B16F10 cells

腫瘤細胞遷移和侵襲運動的能力與黑素瘤預后密切相關，遷移和侵襲運動的能力越強，腫瘤越易早期轉移，預后越差。研究表明，木犀草素對腫瘤細胞的侵襲能力也有顯著的抑制作用［4］，與該研究結果一致，本研究通過Transwell檢測發現，與對照組相比，木犀草素處理顯著降低A375和B16F10細胞的侵襲能力。文獻報道，VEGF在CMM中過表達，促進細胞侵襲和轉移，而抑制VEGF表達能夠減少新生血管的生成，從而抑制細胞增殖和侵襲［13］。有文獻報道，木犀草素發揮抗癌作用還與其抑制血管生成作用有關［6］。與以上研究結果一致，木犀草素能夠顯著降低A375和B16F10細胞中VEGF的表達。以上研究結果表明，木犀草素能夠通過抑制細胞侵襲，降低VEGF的表達來發揮抗黑素瘤作用。

圖5 木犀草素對A375和B16F10細胞中p?Akt、Akt、p?mTOR和mTOR表達的影響Fig.5 Effect of luteolin on the p?Akt，Akt，p?mTOR and mTORexpression in A375 and B16F10 cells

本文以上研究結果已經表明，木犀草素具有抑制黑色素瘤細胞增殖、侵襲、VEGF表達，且促進細胞凋亡的生物學作用，因此我們進一步初步探討潛在的分子機制。PI3K/Akt/mTOR信號通路與腫瘤的發生密切相關，能夠調節細胞周期、細胞遷移、蛋白合成、能量代謝等眾多生命活動［14］，在黑素瘤的發生發展過程中具有重要的調控作用［15］。研究表明，木犀草素通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路在人絨毛膜癌細胞的治療中發揮重要作用［16］。在本研究中，筆者發現木犀草素能夠抑制A375和B16F10細胞中p?Akt和p?mTOR的蛋白水平，與前人研究結果一致，說明木犀草素對黑素瘤細胞增殖、侵襲和凋亡的調控可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

綜上所述，本研究證實了木犀草素具有抗黑素瘤的能力，能夠抑制黑素瘤細胞A375和B16F10的增殖和侵襲能力，并誘導細胞凋亡，這可能與其降低VEGF表達，抑制PI3K?Akt?mTOR信號通路的作用有關。該發現為木犀草素在CMM治療上的臨床應用提供了理論依據。但是，本研究僅在體外細胞水平證實了木犀草素的抗黑素瘤作用，后期仍需在體內明確其作用，且還需更加詳細地闡明其分子調控機制。