尿可溶性CD163在慢性移植腎腎損傷中的作用

楊迷玲 徐憲偉 張果 曲青山 楊金花

鄭州人民醫院1病理科，2器官移植科（鄭州450003）

腎移植是腎功能衰竭患者的有效治療手段。隨著外科技術的發展和新型免疫抑制劑的發現，腎移植受者的短期存活率顯著提高，但移植腎的長期存活狀況并沒有明顯改善［1］。慢性移植腎腎損傷（chronic kidney allograft injury，CAI）是影響移植腎長期存活的主要因素。主要表現為移植腎功能進行性減退，最終可導致腎功能衰竭。預防CAI是提高移植腎存活率的主要目標之一。然而，CAI的發生原因和機制尚不清楚，CAI缺乏早期診斷的生物標志物。因此，本研究用ELISA法和免疫組化法分別檢測尿可溶性CD163水平和移植腎組織中CD163和SMA的表達情況，進一步分析尿可溶性CD163水平和CD163標記的M2型巨噬細胞與移植腎間質纖維化和患者腎功能的關系。

1 材料與方法

1.1標本來源選取鄭州人民醫院病理科2014年至2017年病理診斷為慢性移植腎腎損傷的石蠟標本30例，其中男18例，女12例，年齡18～53歲。按Banff 2017年移植腎活檢診斷標準慢性移植腎腎損傷間質纖維化分3級：Ⅰ級12例，Ⅱ級10例，Ⅲ級8例，用Masson三色染色評估間質纖維化來選取標本；同時選取10例正常腎組織作為對照，在選取標本時已除外其他已知原因引起的間質纖維化和腎小管萎縮，只選取非特定致病因素引起的間質纖維化和腎小管萎縮，不伴有腎小管炎和動脈內膜炎；在做腎穿刺的當天留取晨尿10 mL，置于尿管中，以2 000 r/min離心10 min，然后吸取上層尿液分裝于1.5 mL離心管中并作好標記，置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2主要試劑鼠抗人單克隆抗體CD163（克隆號10D6），鼠抗人單克隆抗體SMA（克隆號1A4）購自福州邁新公司；人sCD163ELISA試劑盒購自美國RD公司。

1.3方法

1.3.1ELISA實驗開始前從冰箱取出試劑盒，平衡至室溫，按照試劑盒說明書配制所需要的稀釋液和洗滌液，并提前將凍存的尿液標本從-80℃冰箱中取出，冰上解凍。實驗操作按試劑盒說明書進行。

1.3.2免疫組化所有組織標本均經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，3 μm厚連續切片，然后用免疫組織化學EliVision法染色。免疫組化操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。預處理：CD163采用檸檬酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0）高溫高壓修復，SMA無需修復。經DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，氨水返藍，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片作陽性對照。

1.4結果判定ELISA結果判讀：用全自動酶標儀在450 nm波長讀板，獲取吸光值（OD值），每個標準品和標本的OD值應減去空白孔的OD值后即為最后OD值，然后以標準品濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標畫出標準曲線，并根據OD值計算出樣品sCD163濃度。然后樣品復孔取平均值。

用Masson三色染色來評估間質纖維化程度，在400倍鏡下，每張切片隨機選取25個視野，陽性染色面積占整個區域的比值即為纖維化的程度［2］。

免疫組化結果的判讀［3］：CD163標記M2型巨噬細胞，胞漿棕黃色判讀為陽性，在400倍鏡下，每張切片至少連續計數9個高倍視野，再取其平均值，SMA標記活化的肌纖維母細胞，胞漿棕黃色為陽性。陽性區域計算方法：在200倍鏡下，每張切片至少計數6個中倍視野的腎皮質區，避開腎小球和大血管。將所選視野用蔡司顯微鏡進行拍照，再將圖片輸入Imagepro plus 6.0圖像處理軟件對圖片進行定量檢測。

1.5統計學方法應用SPSS 18.0軟件進行統計分析。均數用表示，組間比較用方差分析，相關性分析采用Spearman等級相關性分析。檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1Masson三色染色評估移植腎間質纖維化的程度按Banff 2017年［4］移植腎活檢診斷標準分3級：（1）Ⅰ級：輕度間質纖維化，累及范圍＜25%的腎實質；（2）Ⅱ級；中度間質纖維化，累及范圍達到26%～50%的腎實質；（3）Ⅲ級：重度間質纖維化，累及范圍＞50%的腎實質。

2.2CAI患者及正常人尿sCD163水平、血肌酐和尿素氮水平（表1）sCD163在CAI患者尿液中的表達水平顯著高于正常人，隨著移植腎間質纖維化級別的升高，sCD163表達水平逐漸增加，患者的血Cr和BUN平均值也逐漸升高，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 CAI患者及正常人尿sCD163水平、血肌酐和尿素氮水平Tab.1 Levels of urinary sCD163，serum creatinine and urea nitrogen in patients with CAI and normal subjects ±s

表1 CAI患者及正常人尿sCD163水平、血肌酐和尿素氮水平Tab.1 Levels of urinary sCD163，serum creatinine and urea nitrogen in patients with CAI and normal subjects ±s

纖維化程度正常Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級例數10 12 10 8 sCD163（ng/mL）0.36±0.05 1.53±0.27 3.66±0.85 5.71±1.02血Cr（μmol/L）65.80±3.99 172.75±24.55 266.20±27.99 447.88±48.52 BUN（mmol/L）4.87±0.84 16.78±2.19 28.10±3.07 42.88±4.52

2.3CD163和SMA在移植腎組織和正常腎組織中的表達（表2和圖1）CD163標記的M2型巨噬細胞在移植腎組織間質中的數量顯著高于正常腎組織，并且隨著移植腎間質纖維化程度的加重，M2型巨噬細胞的數量也增多，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各級纖維化的移植腎組織中SMA和CD163的相對表達量Tab.2 Relative expression of SMA and CD163 in kidney allografts ±s

表2 各級纖維化的移植腎組織中SMA和CD163的相對表達量Tab.2 Relative expression of SMA and CD163 in kidney allografts ±s

纖維化程度正常Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級例數10 12 10 8 SMA 2.90±1.19 21.00±2.69 39.00±4.69 63.75±9.22 CD163 2.70±2.05 91.50±25.36 263.10±51.25 394.75±124.61

SMA在移植腎組織間質中的陽性區域面積顯著高于正常腎組織，并且隨著移植腎間質纖維化級別的升高而增大，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 移植腎組織中Masson三色染色及免疫組化CD163和SMA的表達Fig.1 Masson tricolor staining and immunohistochemical expression of CD163 and SMA in kidney allografts

2.4 尿sCD163與移植腎組織中M2型巨噬細胞的數量和血Cr的相關性（圖2）隨著移植腎間質纖維化級別的升高，尿sCD163水平逐漸增加，M2型巨噬細胞的數量也逐漸增多，二者呈正相關（r=0.847，P ＜0.001）。尿sCD163水平與血Cr水平呈正相關（r=0.916，P ＜0.001）。

圖2 尿sCD163水平與移植腎組織中CD163+的M2型巨噬細胞和血清Cr水平的相關性Fig.2 Correlation between urinary sCD163 levels and CD163 positive M2 macrophages and Serum Cr levels in kidney allografts

2.5 腎組織中CD163+的M2型巨噬細胞與SMA陽性面積和患者血Cr的相關性（圖3）隨著移植腎間質纖維化級別的升高，SMA陽性區域面積逐漸增大，M2型巨噬細胞的數量也逐漸增多，二者呈正相關（r=0.963，P ＜0.001）。M2巨噬細胞的數量與血Cr水平呈正相關（r=0.937，P＜0.001）。

圖3 移植腎組織中CD163+的M2巨噬細胞與間質纖維化程度和血清Cr水平的相關性Fig.3 Correlation between CD163 positive M2 macrophages and interstitial fibrosis and serum Cr levels in kidney allografts

3 討論

慢性移植腎腎病（CAN）是影響腎移植患者遠期效果的主要因素。CAN在組織學上主要表現為間質纖維化和腎小管萎縮，然而這些組織學表現不具有特異性，在多種移植腎腎病中均可見到，比如免疫抑制劑的藥物毒性、慢性排斥反應、病毒感染等。2007年發表的新班夫分類，摒棄了CAN一詞，代之以更準確的術語“間質纖維化和腎小管萎縮，非特定因素所致”，命名為慢性移植腎腎損傷（CAI）［5］。2017 年的班夫分類重新定義了慢性活動性T細胞介導的排斥反應，強調了間質纖維化和腎小管萎縮區的炎癥（i?IFTA）的重要性，中度的i?IFTA伴中或重度的小管炎即可診斷為慢性活動性T細胞介導的排斥反應，工作組認為i?IFTA與移植物的存活率降低有關［4］。本研究在選取標本時已將已知原因引起的間質纖維化和腎小管萎縮排除在外，并且不伴有小管炎和動脈內膜炎。

CD163是一種分子量約為130 kD的單鏈跨膜糖蛋白，屬于富含半胱氨酸的清道夫受體超家族，是血紅蛋白-觸珠蛋白復合物的清道夫受體，特異性的表達于單核巨噬細胞膜表面，其在體內有兩種存在形式：一種是膜結合型，以跨膜大分子的形式存在于巨噬細胞膜上；而另一種是可溶性CD163，存在于血漿或其它組織液內。CD163是M2型巨噬細胞的標記物，在一定的炎癥刺激下，通過金屬蛋白酶的水解作用從胞膜上脫落，并擴散到炎癥組織或以其可溶形式進入循環，發揮抗炎作用［6-8］。

CAI的發病機制還不清楚。巨噬細胞在多種腎疾病中聚集是一種普遍現象，包括炎癥性、非炎癥性腎疾病和移植腎損傷。巨噬細胞可以被極化成兩種不同的表型，即M1和M2。M1型巨噬細胞具有促炎表型，常與組織損傷有關，而M2型巨噬細胞則是替代途徑活化的巨噬細胞，被認為是抗炎表型，常與組織修復有關［9-10］。研究表明CD163陽性的M2型巨噬細胞與多種腎臟疾病的慢性損傷有關，比如在糖尿病腎病（DN）中，腎間質浸潤的M2型巨噬細胞與腎間質纖維化、腎小管萎縮、DN分級和腎功能損傷有關［11］。有研究用小鼠單側輸尿管梗阻（UUO）模型來研究巨噬細胞與腎纖維化的關系，研究發現腎損傷后募集的巨噬細胞極化為M2型，M2型巨噬細胞可以促進腎纖維化。消除M2型巨噬細胞可特異性地抑制腎纖維化，而消除M1型巨噬細胞則無此作用［2］。本研究結果顯示CD163標記的M2型巨噬細胞在移植腎組織間質中的數量顯著高于正常腎組織，并且隨著移植腎間質纖維化程度的加重，M2巨噬細胞的數量也逐漸增多，與前述研究結果一致。有研究通過小鼠腎移植模型研究顯示骨髓源性的M2型巨噬細胞可以轉化為SMA陽性的肌成纖維細胞，進一步促進小鼠移植腎纖維化［12］。SMA是肌成纖維細胞特異的標志蛋白，在腎損傷發生時，大量生長因子和細胞因子相互作用，促使肌成纖維細胞大量增殖、活化。急劇增加的肌成纖維細胞致使細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的合成增加，增加的ECM沉積于腎間質，正常腎組織結構被破壞、腎功能受損，最終發生間質纖維化［13］。本研究發現SMA在移植腎組織中的陽性面積顯著高于正常腎組織，而且隨著移植腎間質纖維化級別的升高而增大，SMA陽性面積與M2型巨噬細胞的數量具有顯著的一致性，并且M2型巨噬細胞主要位于間質纖維化區域。進一步分析顯示患者血清Cr的平均值與M2型巨噬細胞的數量具有顯著的相關性，隨著移植腎組織間質纖維化程度的加重而升高，這表明M2型巨噬細胞聚集可以促進移植腎間質纖維化的發生發展，引起移植腎功能不全。

有研究認為尿sCD163水平與活動性腎血管炎密切相關，尿sCD163是診斷活動性腎血管炎明顯優于尿蛋白排泄率的生物標志物［14］。還有研究認為sCD163可能在漢灘病毒感染后急性腎功能衰竭的發生發展中起重要作用［15］。本研究通過ELISA法檢測了CAI患者尿sCD163水平，結果發現CAI患者尿sCD163水平顯著高于正常人，并且隨著移植腎間質纖維化的進展，尿sCD163水平逐漸升高。相關性分析顯示尿sCD163水平與移植腎活檢組織中CD163陽性的M2型巨噬細胞的數量呈正相關，隨著患者血Cr和尿素氮水平的升高，尿sCD163水平和移植腎組織中CD163陽性的M2型巨噬細胞的數量也逐漸升高，這說明尿sCD163水平可作為CAI患者M2型巨噬細胞依賴性的生物標志物。這與ENDO等［16］的研究結果一致，認為狼瘡性腎炎患者腎小球中浸潤的細胞主要是CD163陽性的M2型巨噬細胞，尿sCD163水平與CD163陽性的M2型巨噬細胞的數量呈正相關，且與狼瘡性腎炎的活動度相關。

以往關于M2型巨噬細胞在腎損傷中的作用多集中在原發腎疾病或移植腎動物模型上，在國內罕見關于尿sCD163水平在CAI中的研究。本研究初步探討了尿sCD163和CD163陽性的M2型巨噬細胞在CAI中的作用，結果顯示CD163陽性的M2型巨噬細胞可以促進移植腎間質纖維化的發生，引起腎移植患者的腎功能不全，最終導致腎功能衰竭，尿sCD163水平可作為CAI患者M2型巨噬細胞依賴性的生物標志物。因此，筆者推測在臨床腎移植工作中可以定期檢測患者尿液中sCD163水平來預測腎移植患者間質纖維化發生的可能性，對臨床防止移植腎纖維化有著重要意義。