血漿硬化蛋白在股骨頭壞死早期診斷及病情監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

陳嘵俊 黃俊遠(yuǎn) 陳鎮(zhèn)秋 周迎春 何偉 魏秋實(shí)

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州 510405）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（廣州 510405）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是一種好發(fā)于中青年的難治性、致殘性骨科疾病，主要由于各種原因引起股骨頭內(nèi)血供受損或中斷，引起骨髓成分或骨細(xì)胞凋亡，隨后股骨頭結(jié)構(gòu)改變、塌陷，最終不可避免地行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)［1］。據(jù)報(bào)道，在我國(guó)初次行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，需要花費(fèi)8 000～10 000美元，這給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)［2］。股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制仍不明確，目前多認(rèn)為與骨細(xì)胞凋亡、血運(yùn)障礙、頭內(nèi)高壓、脂肪代謝紊亂及基因多態(tài)性有關(guān)［3-4］。骨細(xì)胞是成熟骨骼中數(shù)量最多的細(xì)胞，占約90%～95%，同時(shí)也是壽命最長(zhǎng)的細(xì)胞。它可通過(guò)調(diào)節(jié)骨重建細(xì)胞（包括破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞）的功能，因此對(duì)保持骨穩(wěn)態(tài)具有重要作用。其中最主要的是通過(guò)分泌硬化蛋白抑制Wnt/β信號(hào)通路以減少成骨細(xì)胞活性［5］。

硬化蛋白主要與兩種罕見的遺傳性疾病有關(guān)，包括硬化癥和van Buchem病，目前認(rèn)為SOST基因的失活突變引起了骨骼持續(xù)性過(guò)度生長(zhǎng)［6］。盡管SOST基因在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中在軟骨，骨髓，心臟和腎等組織中均有表達(dá)，但硬化蛋白主要由骨細(xì)胞分泌［7］。雖然目前股骨頭壞死確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但多認(rèn)為骨細(xì)胞凋亡與骨壞死有關(guān)。有報(bào)道指出骨細(xì)胞凋亡與激素性、酒精性股骨頭壞死密切相關(guān)［4，8-9］。因此，在股骨頭壞死發(fā)展過(guò)程中骨細(xì)胞凋亡增加，可能會(huì)伴隨著主要由其分泌的硬化蛋白水平下降。股骨頭壞死的發(fā)展過(guò)程與硬化蛋白水平有無(wú)聯(lián)系尚缺少研究，本研究將探討血漿硬化蛋白與股骨頭壞死發(fā)展的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1股骨頭壞死組選取同期廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院三骨科住院的股骨頭壞死患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2015年發(fā)表的股骨頭壞死臨床診療規(guī)范的診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］；（2）符合ARCO分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有糖尿病、心血管疾病、高血壓、HIV感染等慢性病史。

1.1.2對(duì)照組選取同期在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心體檢，年齡和性別匹配的健康者作為對(duì)照。排除近半年使用過(guò)激素、降脂藥物或影響骨代謝藥物者。兩組患者既往未患高血壓、冠心病、糖尿病等慢性疾病。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者和健康志愿者都簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本采集空腹抽取兩組觀察對(duì)象外周靜脈血約2 mL，離心后將血漿放在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血漿硬化蛋白的檢測(cè)使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）開發(fā)試劑盒（R&D Systems，USA）測(cè)試血漿硬化蛋白水平。該試劑盒的靈敏度為3.8 pg/mL。試劑盒批內(nèi)變異CV%＜3；批間變異CV%＜11。回收率：91%～108%。所有檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3主要觀察指標(biāo)（1）股骨頭壞死患者與正常對(duì)照組血漿硬化蛋白水平差異；（2）不同病因、分期的血漿硬化蛋白水平差異；（3）股骨頭壞死患者硬化蛋白水平與病因、分期的相關(guān)性分析；（4）血漿硬化蛋白診斷股骨頭壞死塌陷效率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，作圖使用GraphPad Prism 7.0、MedCal進(jìn)行。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。股骨頭壞死患者和健康對(duì)照之間的性別、年齡比較采用卡方檢驗(yàn)；兩組間硬化蛋白水平差異采用t檢驗(yàn)；不同病因、分期及分型間的差異采用單因素方差分析。硬化蛋白水平與ARCO分期相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。血漿硬化蛋白診斷股骨頭壞死塌陷的敏感性及特異性通過(guò)繪制ROC曲線比較。P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1兩組基線資料分析股骨頭壞死組最終納入的股骨頭壞死患者共98例，其中男74例，女24例，年齡（43.4±12.3）歲。激素性股骨頭壞死30例，酒精性43例，創(chuàng)傷性10例，特發(fā)性15例。ARCOⅡ期10例，Ⅲ期38例，Ⅳ期50例。對(duì)照組共96人，其中男性68人，女性28人，年齡（41.7±13.4）歲。兩組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 股骨頭壞死組與對(duì)照組基線資料Tab.1 Baseline data of patients with osteonecrosis of the femoral head

2.2股骨頭壞死組內(nèi)以及與對(duì)照組組間血漿硬化蛋白水平比較（1）兩組間血漿硬化蛋白水平比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：股骨頭壞死組血漿硬化蛋白水平明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）不同病因、分期及分型間比較采用單因素方差分析，結(jié)果提示：①股骨頭壞死不同病因患者的血漿硬化蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。②股骨頭壞死不同ARCO分期間血漿硬化蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)Ⅳ期患者明顯低于Ⅱ期患者（P＜0.05）。③股骨頭壞死塌陷前后血漿硬化蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3股骨頭壞死患者血漿硬化蛋白水平與ARCO分期相關(guān)性分析結(jié)果血漿硬化蛋白水平與ARCO分期顯著相關(guān)，與其呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.250，P=0.013）。見圖1。

表2 股骨頭壞死組內(nèi)以及與對(duì)照組組間血漿硬化蛋白水平比較Tab.2 Comparison of plasma sclerostin levels within the femoral head necrosis group as well as with the control group

圖1 血漿硬化蛋白水平與股骨頭壞死ARCO分期的相關(guān)性Fig.1 Correlation between plasma sclerotherapy level and ARCO stage of osteonecrosis of the femoral head

2.3 ROC曲線分析血漿硬化蛋白診斷塌陷效率特異性和敏感性通過(guò)使用MedCalc繪制ROC曲線并分析比較。區(qū)分塌陷前后的曲線下面積為0.748，敏感性為59.09%，特異性為90.00%，cut?off值為≤299.45 pg/mL。說(shuō)明血漿硬化蛋白水平在診斷股骨頭壞死塌陷時(shí)具有顯著的特異性和敏感性。見圖2。

3 討論

圖2 血漿硬化蛋白水平在診斷股骨頭壞死塌陷時(shí)的敏感性和特異性Fig.2 Sensitivity and specificity of plasma sclerostin in the diagnosis of collapse of osteonecrosis of the femoral head

股骨頭壞死是一種好發(fā)于30～50歲中青年患者的致殘性難治性骨科疾病［1］。據(jù)中國(guó)最新股骨頭壞死流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告指出［11］，我國(guó)現(xiàn)患人數(shù)約500萬(wàn)～700萬(wàn)，并以10萬(wàn)～20萬(wàn)例/年的速度增長(zhǎng)。此研究對(duì)2010年1月到2013年12月國(guó)內(nèi)9家大型三甲醫(yī)院的6 395例股骨頭壞死患者數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，30.5%患者需行全髖置換術(shù)，因此給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。這些需要行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的中青年患者，其遠(yuǎn)期必然要面對(duì)翻修甚至是再翻修的殘酷現(xiàn)實(shí)，所以，保留患者自身髖關(guān)節(jié)具有很高的臨床、社會(huì)價(jià)值。同時(shí)，股骨頭壞死的塌陷，是發(fā)展過(guò)程的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，直接影響到患者預(yù)后以及保髖療效，因此及時(shí)、精確的診斷股骨頭壞死，及早予以保髖治療顯得尤為重要［12］。

目前公認(rèn)MRI是最準(zhǔn)確的早期診斷股骨頭壞死的檢查方法，但是從使用激素治療到發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死往往存在3到12個(gè)月不等的時(shí)間窗［13］，同時(shí)因?yàn)镸RI檢查費(fèi)用較高，過(guò)程較繁瑣，特別是在欠發(fā)達(dá)地區(qū)，不可能短期內(nèi)反復(fù)行MRI檢查［14］，因此使MRI早期診斷股骨頭壞死的效能大打折扣。所以找到一種便捷、經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)篩查或發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死顯得尤為重要。

由SOST基因編碼的硬化蛋白主要由骨細(xì)胞分泌，而骨細(xì)胞是成熟骨骼中數(shù)量最多、壽命最長(zhǎng)的細(xì)胞，可通過(guò)分泌硬化蛋白抑制Wnt/β信號(hào)通路以減少成骨細(xì)胞活性［5］。目前，股骨頭壞死的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，但學(xué)者們認(rèn)為骨細(xì)胞凋亡在其中發(fā)揮重要作用，已有大量研究證明骨細(xì)胞凋亡與各種病因的股骨頭壞死密切相關(guān)［15-17］。所以理論上硬化蛋白會(huì)隨著股骨頭壞死的發(fā)生、發(fā)展而分泌減少。在本研究中，我們的研究結(jié)果確實(shí)證實(shí)了股骨頭壞死組的血漿硬化蛋白水平顯著低于健康對(duì)照組。同時(shí)，其與ACRO分期呈負(fù)相關(guān)，而且塌陷后明顯降低，因此，測(cè)量硬化蛋白濃度可能有助于診斷、監(jiān)控股骨頭壞死的發(fā)生與進(jìn)展。

本研究還發(fā)現(xiàn)不同病因的股骨頭壞死患者血漿硬化水平無(wú)顯著差異，其中的原因可能是各種病因的股骨頭壞死均會(huì)出現(xiàn)骨細(xì)胞凋亡增加所致。WEINSTEIN等人［8］通過(guò)病理學(xué)檢測(cè)證明了骨細(xì)胞凋亡與激素性股骨頭壞死有關(guān)。BRABNIKOVA等人［9］觀察到接受激素治療的患者中，包括硬化蛋白等生化指標(biāo)會(huì)顯著下降。MUTIJIMA等［4］發(fā)現(xiàn)激素性、酒精性、創(chuàng)傷性以及特發(fā)性股骨頭壞死患者的骨細(xì)胞凋亡顯著多于骨關(guān)節(jié)炎組。雖然股骨頭特發(fā)性壞死的機(jī)制尚不完全清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性股骨頭壞死中一氧化氮合酶表達(dá)增加與骨細(xì)胞凋亡有關(guān)［18］。這些研究表明各種病因的股骨頭壞死均與骨細(xì)胞凋亡增加相關(guān)，所以理論上各種病因股骨頭壞死的硬化蛋白水平均會(huì)下降，而我們的發(fā)現(xiàn)與這些研究保持一致。

綜上所述，股骨頭壞死患者的血漿硬化蛋白水平顯著降低，與ARCO分期呈負(fù)相關(guān)，并且塌陷后明顯下降。因此硬化蛋白有可能作為股骨頭壞死早期診斷、病情監(jiān)控的生化標(biāo)志物，但其具體的機(jī)制及臨床價(jià)值仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和臨床研究來(lái)證實(shí)。