體外循環(huán)期間應(yīng)用右美托咪定對豬外周血單核細(xì)胞TLR?4，5/NF?κB信號通路的影響

羅琳 魏曉 陳梅珠 李美霞

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院，海口市人民醫(yī)院（海口570208）

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）通過復(fù)雜的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），嚴(yán)重影響心臟外科手術(shù)患者的預(yù)后［1］。此過程中，細(xì)胞膜上Toll樣受體的激活為啟動因子，NF?κB則處于核心環(huán)節(jié)，為SIRS的最后基因通路［2］。右美托咪定作為一種新型α2受體激動藥，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，廣泛用于各種手術(shù)的麻醉。有研究表明［3-5］右美托咪定有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，可減輕CPB誘發(fā)的SIRS，但相關(guān)研究僅限于對結(jié)果的觀察，未涉及機(jī)制探討，本研究旨在從作用機(jī)制上探討CPB期間應(yīng)用右美托咪定對SIRS的影響。

1 材料與方法

1.1動物模型制備與分組

1.1.1五指山小型豬CPB模型的構(gòu)建麻醉誘導(dǎo)后氣管插管行機(jī)械通氣，常規(guī)消毒鋪巾，切開皮膚后劈胸骨，暴露心臟，靜脈給予肝素5 mg/kg，使ACT持續(xù)＞500 s，分別在主動脈根部和右房插管建立體外循環(huán)，待15 min的前并行循環(huán)后，確定管道連接無誤，然后停止機(jī)械通氣，開始完全CPB，持續(xù)體外循環(huán)灌注2 h，灌注量為80～100 mL/kg，灌注壓為60～80 mmHg，CPB均以醋酸林格氏液和聚明膠肽注射液預(yù)充（40 mL/kg）。

1.1.2動物分組五指山小型母豬20頭，隨機(jī)分為4組（n=5）：右美托咪定組（D組）在麻醉誘導(dǎo)前靜脈輸注右美托咪定1 μg/kg負(fù)荷量，隨后以0.5 μg（/kg·h）速率輸注至手術(shù)完畢；右美托咪定+育亨賓組（DY組）在給予右美托咪定前20 min緩慢注射鹽酸育亨賓1 mg/kg，隨后靜脈輸注右美托咪定1 μg/kg負(fù)荷量，并以0.5 μg（/kg·h）速率輸注至手術(shù)完畢；育亨賓組（Y組）麻醉誘導(dǎo)前緩慢注射鹽酸育亨賓1 mg/kg；對照組（C組）麻醉誘導(dǎo)前給予等量生理鹽水。

1.2標(biāo)本的采集及處理分別在CPB前（T0）、CPB后1、2 h（T1、T2）、停CPB后1、2 h（T3、T4），5個時間點采集豬頸動脈血10 mL，取6 mL血用淋巴細(xì)胞分離液按密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞（PBMC），加Trizol置-70℃冰箱保存，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周CD16+單核細(xì)胞TLR4、5和NF?κB的表達(dá)量；另4 mL血室溫下放置2 h，4℃2 500 r/min離心15 min，留取分離血漿，置于-70℃冰箱保存待測，采用ELISA法檢測血漿中TNF?α濃度。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，重復(fù)測量設(shè)計的計量資料比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，各實驗組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD法。采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件（IBM，Armonk，NY，USA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1實驗動物一般情況的比較4組實驗動物的月齡、體重、白細(xì)胞計數(shù)（WBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、心率（HR）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、平均動脈壓（MAP）和CPB停機(jī)時間之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 4組動物一般情況比較Tab.1 Comparison of four groups with general information（n=5） ±s

表1 4組動物一般情況比較Tab.1 Comparison of four groups with general information（n=5） ±s

項目月齡（月）體重（kg）WBC（109/L）HGB（g/L）HCT（%）HR（次/min）SBP（mmHg）DBP（mmHg）MAP（mmHg）停機(jī)時間（min）D組14.50±2.26 15.17±2.32 22.33±1.72 140.33±4.80 43.27±1.86 99.50±5.13 128.83±8.98 81.83±8.93 97.50±9.09 36.17±3.13 DY組15.17±2.72 14.83±2.14 23.26±1.27 141.67±4.81 42.33±2.16 98.83±4.49 129.94±10.07 80.33±7.74 96.83±8.47 34.17±4.07 Y組15.00±1.79 15.33±2.50 23.07±1.75 139.56±3.45 42.83±1.94 102.17±4.83 131.00±12.85 82.50±10.21 98.67±11.18 37.50±2.88 C組13.67±1.63 13.93±1.72 23.11±1.67 144.17±3.31 44.17±1.95 98.50±4.76 124.33±8.89 75.67±6.09 92.17±6.79 34.67±3.83 F值0.594 0.565 0.402 1.446 0.951 0.718 0.497 0.811 0.617 1.112 P值0.626 0.644 0.753 0.259 0.435 0.553 0.701 0.503 0.612 0.368

2.24組實驗動物不同時點外周血CD16+單核細(xì)胞TLR4、TLR5、NF?κB陽性表達(dá)率（%）的比較與T0比較，4組實驗動物在T1～T4時外周血CD16+單核細(xì)胞TLR4、TLR5、NF?κB陽性表達(dá)率均增高（P＜0.05）；與C組比較，D組在T1～T4時外周血CD16+單核細(xì)胞TLR4、TLR5、NF?κB陽性表達(dá)率均降低（P＜0.05）；與D組比較，DY組和Y組在T1～T4時外周血CD16+單核細(xì)胞TLR4、TLR5陽性表達(dá)率均增高（P＜0.05）。（見表2、3和表4及圖1、2和圖3）。

2.34組實驗動物不同時點血漿中TNF?α濃度的比較與T0比較，4組實驗動物在T1～T4時血漿中TNF?α濃度均升高（P＜0.05）；與C組比較，D組在T1～T4時血漿中TNF?α濃度均降低（P＜0.05）；與D組比較，DY組和Y組在T1～T4時血漿中TNF?α濃度均增高（P＜0.05）。見表5及圖4。

表2 4組實驗動物不同時點外周血CD16+單核細(xì)胞TLR4陽性表達(dá)率（%）的比較Tab.2 Comparison of four groups with positive expression rate of TLR4（n=5） ± s

表2 4組實驗動物不同時點外周血CD16+單核細(xì)胞TLR4陽性表達(dá)率（%）的比較Tab.2 Comparison of four groups with positive expression rate of TLR4（n=5） ± s

注：與T0時比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05；與D組比較，cP＜0.05；與Y組比較，dP＜0.05

組別D組DY組Y組C組F值P值T0 1.71±0.09 1.66±0.08 1.69±0.12 1.65±0.09 0.380 0.769 T1 3.32±0.10abd 5.02±0.11acd 5.11±0.10abc 4.94±0.10acd 381.204＜0.01 T2 4.39±0.14abd 8.05±0.15acd 8.52±0.18abc 7.93±0.17acd 680.035＜0.01 T3 4.55±0.15abd 9.24±0.18acd 9.73±0.19abc 9.12±0.17acd 881.115＜0.01 T4 4.22±0.17abd 7.85±0.19acd 8.26.±0.12abc 7.75±0.18acd 626.387＜0.01 F值2 301.732 6 929.702 6 903.743 4 717.646 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

表3 4組實驗動物不同時點外周血CD16+單核細(xì)胞TLR5陽性表達(dá)率（%）的比較Tab.3 Comparison of four groups with positive expression rate of TLR5（n=5） ± s

表3 4組實驗動物不同時點外周血CD16+單核細(xì)胞TLR5陽性表達(dá)率（%）的比較Tab.3 Comparison of four groups with positive expression rate of TLR5（n=5） ± s

注：與T0時比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05；與D組比較，cP＜0.05；與Y組比較，dP＜0.05

組別D組DY組Y組C組F值P值T0 1.11±0.10 1.18±0.14 1.17±0.12 1.15±0.11 0.359 0.783 T1 2.15±0.11abd 4.16±0.21acd 4.38±0.10abc 4.16±0.12acd 259.5＜0.001 T2 3.39±0.29abd 7.01±0.17acd 7.57±0.14abc 7.19±0.11acd 520.066＜0.001 T3 3.69±0.22abd 8.22±0.12acd 8.75±0.12abc 8.44±0.19acd 974.107＜0.001 T4 3.27±0.21abd 7.43±0.12acd 7.91±0.07abc 7.59±0.16acd 1 445.803＜0.001 F值172.20 2 989.997 10 285.85 9 149.249 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

表4 4組實驗動物不同時點外周血CD16+單核細(xì)胞NF?κB陽性表達(dá)率（%）的比較Tab.4 Comparison of four groups with positive expression rate of NF?κB（n=5） ± s

表4 4組實驗動物不同時點外周血CD16+單核細(xì)胞NF?κB陽性表達(dá)率（%）的比較Tab.4 Comparison of four groups with positive expression rate of NF?κB（n=5） ± s

注：與T0時比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05；與D組比較，cP＜0.05；與Y組比較，dP＜0.05

組別D組DY組Y組C組F值P值T0 0.53±0.03 0.55±0.05 0.56±0.04 0.54±0.04 0.558 0.650 T1 1.51±0.08abd 2.53.±0.10acd 2.86±0.09abc 2.52±0.08acd 217.935＜0.001 T2 2.50±0.17abd 5.11±0.13acd 5.73±0.14abc 5.19±0.10acd 545.750＜0.001 T3 2.72±0.15abd 5.89±0.12acd 6.16±0.12abc 5.94±0.17acd 669.205＜0.001 T4 2.41±0.14abd 4.90±0.16acd 5.23±0.10abc 4.97±0.11acd 536.115＜0.001 F值825.734 7 557.776 33 60.134 2 065.235 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

圖1 4組不同時點外周血單核細(xì)胞TLR4陽性表達(dá)率變化曲線Fig.1 Comparison of four groups with positive expression rate of TLR4

圖1 4組不同時點外周血單核細(xì)胞TLR5陽性表達(dá)率變化曲線Fig.2 Comparison of four groups with positive expression rate of TLR5

表5 4組實驗動物不同時點血漿中TNF?α濃度（ng/L）的比較Tab.5 Comparison of four groups with serum TNF?α（n=5） ± s

表5 4組實驗動物不同時點血漿中TNF?α濃度（ng/L）的比較Tab.5 Comparison of four groups with serum TNF?α（n=5） ± s

注：與T0時比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05；與D組比較，cP＜0.05

組別D組DY組Y組C組F值P值T0 35.72±5.15 36.86±5.73 37.12±5.49 34.55±6.40 0.214 0.886 T1 39.60±5.58ab 48.77±5.70ac 55.27±6.09ac 49.94±7.22ac 5.510 0.009 T2 44.89±5.46ab 57.24±5.57ac 64.07±6.54ac 58.15±7.04ac 8.469 0.001 T3 51.91±8.13ab 63.13±6.53ac 69.03±5.09ac 65.22±5.13ac 6.726 0.004 T4 43.71±6.33ab 53.08±6.50ac 58.91±5.66ac 54.72±5.78ac 5.572 0.008 F值23.266 175.828 101.374 184.690 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

圖3 4組不同時點外周血單核細(xì)胞NF?κB陽性表達(dá)率變化曲線Fig.3 Comparison of four groups with positive expression rate of NF?κB

圖4 4組不同時點外周血漿中TNF?α變化曲線Fig.4 Comparison of four groups with serum TNF?α

3 討論

CPB下心內(nèi)直視手術(shù)已成為挽救心臟疾病患者的最終治療手段。但CPB一旦建立，可迅速激活機(jī)體的體液及細(xì)胞免疫，啟動炎癥“級聯(lián)”反應(yīng)，最終導(dǎo)致SIRS，甚至多器官功能衰竭［6-7］。

TLRs/NF?κB信號通路的激活在CPB誘發(fā)的SIRS中起至關(guān)重要的作用，通過細(xì)胞膜上的TLRs識別危險信號，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)［8］；而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的NF?κB的激活為SIRS的最后基因通路，調(diào)控各種炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生和釋放，其中TNF?α可誘發(fā)細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)多種炎癥因子的合成［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，與T0比較，4組實驗動物在T1～4時外周血CD16+單核細(xì)胞TLR4、TLR5和NF?κB陽性表達(dá)率和血漿中TNF?α均增高，提示CPB激活了TLR?4，5/NF?κB信號通路，促發(fā)SIRS。

右美托咪定（dexmedetomidine）是一種新型α2受體激動藥，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，近年發(fā)現(xiàn)其對機(jī)體免疫功能有調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子生成［11-14］。在BULOW等［15］的研究中發(fā)現(xiàn)，右美托咪定作為麻醉輔助藥物可以降低微型體外循環(huán)后血液中IL?1，IL?6，TNF?α和INF?γ水平。本研究也發(fā)現(xiàn)，與D組比較，其他三組實驗動物在T1～4時血漿中TNF?α濃度增高。既往研究僅限于對結(jié)果的觀察，未涉及到機(jī)制探討。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，與C組比較，D組在T1～4時外周血CD16+單核細(xì)胞TLR4、TLR5及NF?κB陽性表達(dá)率均降低，提示右美托咪定可抑制TLR?4，5/NF?κB信號通路激活。與D組比較，DY組實驗動物在T1～4時外周血CD16+單核細(xì)胞TLR4、TLR5及NF?κB陽性表達(dá)率以及血漿中TNF?α濃度均增高。表明特異性α2受體拮抗劑育亨賓能夠拮抗右美托咪定的免疫調(diào)節(jié)作用，證實了右美托咪定是通過興奮α2受體起到抑制TLR?4，5/NF?κB信號通路激活，從而降低炎性細(xì)胞因子的生成，減輕CPB誘發(fā)的SIRS。

綜上所述，右美托咪定可減輕豬體外循環(huán)期間全身炎癥反應(yīng)，此作用可被特異性α2腎上腺素能受體拮抗劑——育亨賓所逆轉(zhuǎn)，提示右美托咪定通過興奮α2 受體，抑制TLR?4，5/NF?κB信號通路的激活從而減輕體外循環(huán)誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)。