不同干擾方式下松江濕地土壤微生物群落結構和功能特征

李森森,馬大龍,臧淑英,王璐璐,孫弘哲

哈爾濱師范大學地理科學學院,哈爾濱 150025

濕地作為陸地和水體的過渡區域,是具有豐富生物多樣性和較高生態服務價值的特殊生態系統[1]。微生物參與濕地生態系統的物質循環和能量流動,對維持濕地生態過程和功能具有重要作用[2-4]。微生物對其生存的微環境變化十分敏感,其群落結構和功能都會隨著環境條件的變化而發生迅速改變,是指示濕地生態系統健康狀況的重要生物指標。城市濕地是現代城市生態系統的重要組成部分,具有調節區域小氣候、保障水源水質、緩解城市環境污染等重要生態服務功能。然而,在快速城市化過程中人類干擾活動已經成為城市濕地生態健康水平下降的主要驅動因素。國內外許多研究表明,農業開墾、旅游開發對濕地土壤養分、土壤物理性狀、植物群落多樣性和生態景觀等方面都產生嚴重影響,而對比和辨識不同人為干擾對城市濕地土壤微生物的影響,將有助于深入理解濕地生態系統退化的關鍵驅動因素及其退化機制[5-8]。

土壤微生物群落結構組成極為復雜,而傳統的培養方法僅能分離鑒定1%的微生物,很難全面解析自然狀況下土壤微生物群落結構和多樣性[9-10]。近年來,隨著研究方法的不斷創新和改進,使土壤微生物的研究得到長足的發展。磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid,PLFA)圖譜分析技術是一種快速、可定性和定量分析土壤微生物群落的方法,能夠反映不同生境中微生物群落結構組成和多樣性變化規律[11]。BIOLOG微平板分析法通過土壤微生物對不同碳源利用能力和代謝的差異來表征其功能多樣性,在微生物群落功能的研究中得到廣泛應用[12]。已有的研究結果表明,微生物群落結構和多樣性與多種土壤環境因子(如pH值、有機質、含水量及可利用性的碳、氮等)密切相關[13-16]。因此,通過分析微生物群落結構及功能特征能夠較為快速地反映或預警城市濕地生態環境質量及其變化趨勢。

松江濕地依托松花江主航道,介于哈爾濱市南、北兩城區之間,全長約123 km,總面積約為410 km2,是我國面積最大的天然城市濕地[17]。近年來,隨著城市化的加速發展,工農業污水排放增多,旅游活動日趨頻繁,對松江濕地生態環境造成不同程度的破壞,使其功能和效益受到嚴重影響,研究人為干擾對微生物群落功能和結構的影響規律,是準確估算城市濕地環境承載力的前提。目前對松江濕地的研究多集中在旅游開發與生態修復等領域,尚缺乏對濕地土壤微生物群落結構、功能特征及與環境因子關系的研究。因此,本研究以松江濕地為典型研究區域,采用BIOLOG微平板法和磷脂脂肪酸(PLFA)技術,系統分析4種(農業、工業、旅游和保護)不同干擾方式下土壤微生物代謝功能和群落結構多樣性,探明微生物與土壤環境因子間的響應關系,旨在為揭示人為干擾對濕地生態系統的影響機制和科學評價松江濕地生態服務功能提供理論和科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

松江濕地西起雙城區與道里區交界處,東至大頂子山航電樞紐(126°10′—127°23′E),南北以松花江沿岸堤壩外延2—5 km為界(45°40′—46°03′N),屬典型沼澤化低濕平原地貌的河流濕地,也是我國面積最大的原生態城市濕地,主要包括金河灣濕地、呼蘭河口濕地、太陽島濕地、阿什河濕地、白魚泡濕地、濱江濕地、民主濕地、長嶺湖濕地和陽明灘濕地等,對調節區域氣候、防洪蓄洪、凈化水質環境以及生物多樣性保護起著至關重要作用[18]。該區域屬典型半濕潤大陸性季風氣候,冬季寒冷漫長,夏季炎熱短暫,春、秋季氣溫升降變化較快,年平均氣溫4.3℃,最冷月(1月份)平均氣溫-18.3℃,最熱月(7月份)平均氣溫23℃；年均降水量400—600 mm,降水多集中在夏季。

圖1 研究區及采樣點分布Fig.1 The distribution of Research area and sampling pointsTYD：太陽島濕地,Sun Island wetland；JHW：金河灣濕地,Jinhe Bay wetland；BJG：濱江濕地,Binjiang wetland；HLH：呼蘭河口濕地,Hulan Estuary wetland；ASH：阿什河濕地,Ashi River wetland；BYP：白魚泡濕地,Baiyupao wetland

1.2 樣品采集

2015年7月,根據松江濕地的地域分布特征兼顧采樣可行性和代表性原則,選擇土壤類型相同、地形地貌一致的天然濕地,按照不同人為干擾方式分別設置農業干擾類型(呼蘭河口濕地HLH,周圍有農耕活動,主要干擾源為化肥和農藥污染物),工業干擾類型(阿什河濕地ASH,靠近工業污染源,工業廢水和固體廢棄物等外源污染物輸入較多),旅游干擾類型(金河灣濕地JHW、白魚泡濕地BYP和太陽島濕地TYD,建設有濕地公園,旅游干擾強度較高,主要干擾源為旅游垃圾)和保護類型(濱江濕地BJG,屬沿江生態濕地保護區,人類活動干擾較弱),共6個研究樣地(圖1)。每個樣地中設置5塊10 m×10 m的標準樣方,樣方內以“品”字形設置3個采樣點,用柱狀采樣器采集0—10 cm土壤樣品并立即用聚乙烯無菌袋密封置于冰盒中帶回實驗室,充分混勻后分為3份,一份置于4℃冰箱保存,用于測定土壤微生物代謝活性；一份置于-80℃低溫冰箱冷凍保存,在一周內用于土壤微生物磷脂脂肪酸的提取和分析,另一部分自然風干后研磨用于土壤各理化指標的測定。

1.3 研究方法

1.3.1 土壤理化性質測定

1.3.2 土壤微生物群落功能多樣性測定

采用BIOLOG-ECO微平板法測定土壤微生物群落功能多樣性。每個板有96個孔,分為3組重復,每組32個孔,包括1個對照孔和31個單一碳源孔。根據碳源的化學官能團及微生物代謝途徑的不同,可將31種碳源分為6類：其中碳水化合物類10種、羧酸類7種、氨基酸類6種、多聚物類4種、胺類2種和酚類2種。稱取10 g新鮮土壤置于25℃條件下活化24 h后,放入盛有90 mL無菌NaCl溶液(0.85%)的三角瓶中,在4℃搖床上震蕩30 min(170 r/min),靜置30 min后,將懸浮液稀釋1000倍,用排槍取150 μL的樣品懸液接種于ECO板的每個孔中,對照孔加入150 μL的無菌水,將接種好的ECO板置于25℃恒溫避光培養,分別于0、24、48、72、96、120、144、168、192、216 h和240 h后用Biolog Reader分析儀讀取590 nm的光密度值。

表1 不同干擾方式下松江濕地土壤主要理化性質分析

數值為平均值±標準差；同一列中不同字母表示經多重比較檢驗在a=0.05水平上達到顯著水平；TC：total carbon；TN：total nitrogen；TP：total phosphorus；TC/TN：the ratio of total carbon to total nitrogen

用微平板孔中溶液吸光值平均顏色變化率(AWCD)來代表土壤微生物的總體代謝活性,計算公式如下：

式中,Ci為所測定的第i個碳源孔的光密度值；R為對照孔的光密度值。

1.3.3 土壤微生物群落結構多樣性測定

采用磷脂脂肪酸(PLFA)法測定土壤微生物群落結構,PLFA的分析和提取采用修正的Bligh-Dyer法[20]。稱取8 g凍干土樣,加入35 mL氯仿∶甲醇∶磷酸(1∶2∶0.8)緩沖液,避光震蕩后離心,上清液加入12 mL氯仿和磷酸緩沖液靜置分液,收集氯仿層,N2吹干后轉入硅膠柱,過氯仿、丙酮和甲醇洗脫,棄氯仿(含中性脂)和丙酮(含糖脂),收集甲醇(含磷脂)洗提液。經堿性甲醇溶液水解和皂化,N2吹干后得到磷脂脂肪酸甲酯,加入200 μL甲酯化的C19:0,溶解后作為內標物,使用氣相色譜儀(7890B GC,Agilent Technologies Co.,USA)進行土壤微生物磷脂脂肪酸測定。不同類群微生物具有獨特的PLFA特征譜圖,可根據內標C19:0計算土壤微生物PLFA總量和單個PLFA的含量(nmol/g)。本研究中,細菌用14:0、15:0、16:0、17:0、18:0、20:4ω6c、20:0、22:0表征；革蘭氏陽性菌(G+)用i14:0、i15:0、a15:0、i16:0、a16:0、i17:1ω9c、i17:0、a17:0、i18:0表征；革蘭氏陰性菌(G-)用16:1ω9c、16:1ω7c、16:1ω5c、17:1ω8c、cy17:0ω7c、18:1ω7c、18:1ω5c、cy19:0ω7c表征；放線菌用10Me16:0、10Me17:0、10Me18:0、10Me20:0表征；真菌用18:2ω6c、18:1ω9c、20:1ω9c表征[21- 25]。

1.4 數據分析

土壤微生物群落多樣性采用Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數表征,運用BIO-DAP程序進行計算。采用SPSS 19.0進行單因素方差分析(顯著性水平為α=0.05)。主成分分析(Principal components analysis,PCA)和冗余分析(Redundancy analysis,RDA)在多元統計分析軟件Canoco 5.0中進行。

2 結果與分析

2.1 松江濕地土壤微生物群落功能多樣性

2.1.1 平均顏色變化率(AWCD)分析

圖2 不同干擾方式下松江濕地土壤微生物群落平均顏色變化率 Fig.2 AWCD of soil microbial community in Songjiang wetland under different interference patterns

平均顏色變化率(Average well color development,AWCD)能夠表征土壤微生物的碳源利用能力,也是指示土壤微生物代謝活性的重要指標。如圖2所示,不同干擾方式下松江濕地土壤微生物AWCD值隨培養時間的增加逐漸上升,表明土壤微生物群落活性不斷提高且對碳源的利用能力均呈增加趨勢。在0—24 h培養期內,除保護類型(BJG)外其他干擾方式的濕地土壤微生物群落AWCD值均變化不明顯,說明在24 h內微生物對碳源的利用程度較低。培養24 h后各干擾方式下濕地土壤微生物群落AWCD值呈現指數型增長趨勢,表明微生物群落活性增強,碳源被大幅度利用,其中,受保護的濕地(BJG)土壤微生物群落AWCD值增長最快,而受工業干擾的濕地(ASH)增長最慢；培養144 h后各干擾方式下濕地土壤微生物群落AWCD值增速減緩并趨于穩定。測定結果表明,不同干擾方式下松江濕地土壤微生物對碳源的利用能力存在顯著差異,由強到弱依次為：濱江濕地(BJG)>金河灣濕地(JHW)>白魚泡濕地(BYP)>太陽島濕地(TYD)>呼蘭河口濕地(HLH)>阿什河濕地(ASH)。

2.1.2 土壤微生物對碳源利用水平分析

不同干擾方式下松江濕地土壤微生物對6類碳源的利用程度存在顯著差異,其中羧酸類、糖類和氨基酸類為主要利用碳源,而對多聚物類、酚類和胺類的利用程度相對較低(圖3)。

圖3 不同干擾方式下松江濕地土壤微生物對不同碳源的利用水平Fig.3 The level of different carbon utilization by soil microbial in Songjiang wetland under different interference patterns

農業干擾(HLH)、工業干擾(ASH)和旅游干擾(BYP)的濕地土壤微生物對糖類利用水平皆為最高,分別占總碳源的33.46%、33.38%和32.98%；其次為羧酸類,分別為27.33%、23.9%和27.63%；胺類最低,分別為4.01%、6.54%和3.23%。旅游干擾的JHW和TYD土壤微生物對羧酸類的利用水平最高,分別占總碳源的30.48%和30.41%；其次為糖類,分別為21.97%和23.48%；胺類最低,為3.9%和5.06%。保護類型的BJG土壤微生物對羧酸類的利用水平最高,占總碳源的31.96%；其次為糖類,25.55%；酚類最低,為3.4%?？傮w而言,旅游干擾的TYD和JHW土壤微生物對羧酸類碳源的利用水平顯著高于工業干擾的ASH(P<0.05)；對糖類碳源的利用水平在農業干擾的HLH顯著高于保護類型的BJG和旅游干擾的JHW,但BJG和JHW間差異不顯著(P>0.05)；對氨基酸類碳源的利用水平在旅游干擾的JHW顯著高于工業干擾的ASH和旅游干擾的BYP(P<0.05)。

2.1.3 土壤微生物碳源利用的主成分分析

圖4 不同干擾方式下松江濕地土壤微生物碳源利用的主成分分析Fig.4 PCA of carbon utilization by soil microbial in Songjiang wetland under different interference patterns

研究土壤微生物對不同碳源利用能力的差異,將有助于更全面地了解濕地微生物群落代謝功能特征[26]。對不同干擾方式下松江濕地土壤微生物群落代謝功能多樣性進行主成分分析,其中第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)分別解釋方差變量的74.9%和14.1%,兩個主成分的累計方差貢獻率達到89%,能夠較好的反映微生物對碳源利用效率的變化特征(圖4)。結果表明,不同干擾方式下6個濕地的微生物群落代謝功能分異明顯。農業干擾的HLH、工業干擾的ASH和旅游干擾的TYD位于PC1的正端,空間距離較近,說明濕地間土壤微生物群落代謝功能差異不顯著,但與旅游干擾的JHW、BYP和保護類型的BJG分異明顯；旅游干擾的JHW和BYP集中分布于PC1和PC2的負端,說明兩濕地間土壤微生物群落代謝功能較為相似,但與其他濕地差異較為明顯；保護類型的BJG位于PC1的負端和PC2的正端,與其他濕地存在顯著差異；其中羧酸類和糖類是影響松江濕地微生物群落代謝功能的敏感碳源。

2.2 松江濕地土壤微生物群落結構多樣性

2.2.1 土壤微生物磷脂脂肪酸類型及含量

不同干擾方式下松江濕地土壤樣品中共檢測出47種PLFA,選取大于0.01 nmol/g的32種PLFA進行分析,其中代表細菌的PLFA 8種、革蘭氏陽性菌9種、革蘭氏陰性菌8種、放線菌4種、真菌3種(表2)。松江濕地中含量較高的PLFA主要有18:1ω7c、16:0、18:1ω9c、i17:1ω9c、cy19:0ω7c和16:1ω7c,各濕地的優勢PLFA種類基本相同,但不同類型的PLFA含量存在顯著差異。旅游干擾的TYD F/B最高為0.34,旅游干擾的JHW最低為0.11；旅游干擾的BYP G+/G-最高為0.98,旅游干擾的TYD最低為0.54；旅游干擾的BYP一般飽和脂肪酸/單烯不飽和脂肪酸(Sat/Mon)最高為0.52且顯著高于其他濕地(P<0.05)。

表2 不同干擾方式下松江濕地土壤微生物磷脂脂肪酸類型及含量

數值為平均值±標準差；同一行中不同字母表示經多重比較檢驗在a=0.05水平上達到顯著水平；i：異丙基,isopropyl；a：反異丙基,anti isopropyl；Me：甲基分支脂肪酸,methyl branched fatty acids；cy：環丙基,cyclopropyl；ω：脂肪酸端,fatty acid side；c：順式空間構型,cis space configuration；t：反式空間構型,Trans space configuration

不同干擾方式下松江濕地不同類群土壤微生物磷脂脂肪酸含量具有明顯差異,各濕地土壤細菌(含G-和G+)含量最高,占總PLFA的69.72%—80.97%,顯著高于真菌(9.20%—23.51%)和放線菌(6.77%—9.82%),這說明細菌是松江濕地土壤微生物的主要類群(圖5)。保護類型的BJG總PLFA、BPLFA和G-PLFA含量最高,分別為65.48、58.77 nmol/g和28.44 nmol/g,而旅游干擾的BYP含量最低,分別為28.26、24.30 nmol/g和9.59 nmol/g；工業干擾的ASH G+PLFA含量最高為19.36 nmol/g,旅游干擾的BYP含量最低為9.95 nmol/g；旅游干擾的TYD FPLFA最高為17.89 nmol/g,顯著高于其他濕地(P<0.05)；工業干擾的ASH APLFA最高為6.54 nmol/g,與其他濕地存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 不同干擾方式下松江濕地土壤微生物磷脂脂肪酸總含量 Fig.5 Total content of soil microbial PLFA in Songjiang wetland under different interference patternsBPLFA：細菌PLFA(含G-和G+),bacterial PLFA(include G- and G+)；G-PLFA：革蘭氏陰性菌PLFA,Gram-negative bacterial PLFA；G+PLFA：革蘭氏陽性菌PLFA,Gram-positive bacterial PLFA；FPLFA：真菌PLFA,fungal PLFA；APLFA：放線菌PLFA,Actinomycete PLFA

2.2.2 多樣性指數分析

Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數是評價微生物群落多樣性的常用指標,能夠表征濕地土壤中微生物群落結構的多樣性、優勢度和均勻度。結果表明,保護類型的BJG土壤微生物群落具有最高的多樣性指數(2.994)、均勻度指數(19.464)和最低的優勢度指數(0.037)；工業干擾的ASH多樣性指數最低(2.881),而優勢度指數最高(0.069)且與其他濕地間差異顯著(P<0.05)。農業干擾的HLH均勻度指數最低,為9.068(表3)。

表3 不同干擾方式下松江濕地土壤微生物群落多樣性指數

數值為平均值±標準差；同一行中不同字母表示經多重比較檢驗在a=0.05水平上達到顯著水平

2.2.3 微生物群落結構與環境因子的相關性分析

圖6 不同干擾方式下松江濕地土壤微生物群落結構與環境因子的RDA分析Fig.6 RDA analysis of soil bacterial community structure and environmental factors in Songjiang wetland under different interference patterns

3 討論

人類在城市濕地中的干擾活動十分頻繁,是改變濕地生態系統服務功能最重要的直接驅動力,研究微生物利用不同碳源的能力,可以深入揭示不同干擾方式下濕地土壤微生物群落代謝水平的差異[27- 28]。本研究結果表明,不同干擾方式下松江濕地土壤微生物利用碳源的能力存在差異,其中保護類型的BJG土壤微生物利用單一碳源的能力最強,代謝活性最高,說明較好的濕地生態環境為微生物代謝與繁殖提供了有利條件。而工業干擾的ASH AWCD值最低,土壤微生物群落代謝能力最弱,這可能由于該濕地毗鄰城區和工業區,受工業廢水及固體廢棄物等外源污染較多,土壤中總碳和總氮含量較高,雖然ASH與BJG都具有較高的總PLFA含量,但各優勢微生物的PLFA含量間存在顯著差異(表2),從而使其微生物群落功能出現相應變化。工業干擾破壞原有土壤的穩定性,減小可利用底物的豐度和均勻度,進而降低了微生物的代謝功能。對6類碳源利用率分析結果顯示,松江濕地土壤微生物群落代謝以羧酸類、糖類和氨基酸類碳源為主,而對多聚物類、酚類和胺類碳源的利用率相對較低,羧酸類和糖類是濕地土壤微生物功能多樣性表現出空間異質性的主要碳源類型。

主成分分析(PCA)是一種數學降維的方法,能夠更為直觀的反映不同干擾方式下松江濕地土壤微生物功能多樣性的綜合差異和相似狀況。分析結果表明,受農業干擾(HLH)、工業干擾(ASH)和旅游干擾(TYD)的土壤微生物代謝功能差異不顯著,造成這種現象的原因可能與3個濕地皆位于松花江中游河段人為干擾強度最大,外源污染物輸入導致土壤總碳和總氮含量較高,進而形成適應特殊環境的優勢菌群。杜萍等[29]對椒江口沉積物的研究結果也表明,微生物群落代謝特征與有機質含量關系密切。雖然干擾方式不同但土壤微生物代謝功能差異不大,其原因可用“功能冗余”來解釋,即同一群落中的某些物種在生態功能上有一定程度的重疊。PLFA研究結果表明,不同干擾方式能夠明顯驅動濕地土壤微生物群落結構組成發生較大變化,顯著影響微生物群落中優勢種群的豐度(表2)。因此,在同一干擾條件下,濕地微生物群落結構和代謝功能所表現出的響應程度并不一致。這是由于人為干擾導致濕地土壤微生物群落中優勢種群發生變化,但由于功能的冗余性,其變化程度反應到代謝功能上可能會被稀釋。濕地微生物群落結構對外界干擾條件變化的反應比代謝功能更為敏感,這一結論也與Berga等[30]和王楠楠等[31]的研究結果相一致。雖然JHW和BYP同樣受旅游干擾但開發時間相對TYD較晚,距離市區較遠,受人類旅游干擾強度和頻率相對較弱,因而表現為兩濕地間微生物群落代謝功能相似但與TYD差異明顯。保護類型的BJG受人為干擾較少,與其他濕地微生物代謝功能表現出較大差異。旅游干擾的JHW土壤微生物群落AWCD值較高,但其總PLFA含量相對較低,土壤理化性質又與保護類型的BJG差異不大。這可能是因為旅游干擾帶來大量外源微生物和污染物,顯著影響該濕地土壤微生物群落結構,而微生物代謝功能和土壤理化性質對外界環境變化表現出明顯的滯后性。本研究結果也進一步證明土壤微生物群落結構可以作為快速預警和早期指示城市濕地生態環境健康狀況的敏感生物指標。由于BIOLOG微平板技術具有一定局限性,31種碳源并不能全部反映自然條件下土壤微生物所處的復雜底物環境。因此,本研究通過BIOLOG微平板和PLFA技術相結合,以期更為全面、深入地闡釋不同干擾方式對松江濕地土壤微生物的影響。

在濕地生態系統中,土壤微生物群落結構和多樣性受濕地生物、水文和土壤等多種因素的交互影響[32]。本研究發現松江濕地中好氧微生物真菌和放線菌PLFA量顯著低于細菌,說明濕地水淹環境減少了土壤中溶解氧的含量,導致放線菌和真菌的生長受到抑制,從而降低其在微生物總量中的比例。一般飽和脂肪酸(Sat)和單烯不飽和脂肪酸(Mon)是PLFA的重要組成部分[33],Carrasco等[34]認為Sat/Mon值小于1,則表明該區域有較高的有機質含量和有機碳輸入,這也印證了對人為干擾引起營養物質的輸入量較大導致土壤有機質含量增高,造成松江濕地Sat/Mon值較小的結論。G+細菌對環境脅迫的適應和生存能力強于G-細菌[35],其比值可以表征細菌群落受營養脅迫的程度,松江濕地G+/G-值均小于1,表明濕地生態系統穩定性較差,受到一定的 營養環境脅迫。

4 結論

不同干擾方式下松江濕地土壤理化性質、微生物代謝功能及微生物 PLFA均存在顯著差異。土壤微生物碳源利用能力表現為：濱江濕地(保護)>金河灣濕地(旅游)>白魚泡濕地(旅游)>太陽島濕地(旅游)>呼蘭河口濕地(農業)>阿什河濕地(工業)。微生物利用率最高的碳源是羧酸類,其次是糖類和氨基酸類,其中羧酸類和糖類也是不同干擾方式下松江濕地微生物功能多樣性表現出異質性的主要碳源。保護類型的BJG 總PLFA、BPLFA和G-PLFA含量顯著高于其他濕地,農業、工業和旅游干擾改變了土壤微生物群落組成和結構,顯著降低了微生物生物量和多樣性,導致濕地生態系統穩定性較差。RDA分析初步揭示了不同干擾方式下松江濕地微生物群落對土壤理化性質變化的響應情況,其中氮素和pH是影響濕地土壤微生物群落組成的關鍵環境因子。