SHh、Ptch1蛋白表達水平變化與胰腺癌發生發展的相關性分析

張志勇

(許昌市人民醫院消化內科，河南 許昌 461000)

胰腺癌的發生能夠導致患者病死率的顯著上升，胰腺癌的早期診斷水平較低，疾病的病情進展較為陰離子。流行病學研究顯示，胰腺癌的發病率可達344～566/10萬人左右[1]，且近年來在部位合并有膽道系統疾病的人群中，胰腺癌的發病率更高[2]。

分子生物學因子的改變，能夠通過影響到惡性腫瘤早期發生過程中的細胞生物學特征，干預到癌細胞的增殖、凋亡及分化等病理過程。hedgehog信號通路能夠通過激活癌細胞的轉錄，提高癌細胞的異常增殖的風險，導致惡性腫瘤的發生。Hh配體蛋白（SHh）、Hh 受體蛋白（Ptch1）均為 hedgehog信號通路上主要的核心效應蛋白，其主要表達中胚層組織、新生兒心肌細胞組織及部位平滑肌細胞組織中，近年來相關基礎方面的研究顯示，SHh、Ptch1蛋白能夠促進胰腺上皮細胞或者腺體細胞的持續性DNA核的異常分裂，增加癌細胞的侵襲或者轉移的風險，同時SHh、Ptch1蛋白還能夠在促進腫瘤病灶新生血管的形成，增加腫瘤病灶的血流灌注等方面發揮作用，促進病情的進展[3，4]。 為了進一步探討 SHh、Ptch1 蛋白等在促進胰腺癌發生發展過程中的作用，從而為臨床上胰腺癌的血清學篩查提供依據，本次研究選取我院確診的胰腺癌患者組織標本100例，探討了相關指標的蛋白水平表達及其與胰腺癌患者臨床病理特征的關系，報告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選河南省許昌市人民醫院2014年10月－2017年2月手術后胰腺癌組織標本100例（病灶組）、癌旁組織50例（癌旁組）。病灶組，年齡38～70 歲，平均年齡 53．41±12．57 歲，男性 49 例，女性51例；TNM分期Ⅰ期33例，Ⅱ期36例，Ⅲ期31例；分化程度：高分化38例，中低分化62例；無淋巴轉移44例，有淋巴轉移56例；對照組，年齡36～71 歲，平均年齡 52．46±13．15 歲，兩組年齡差異無統計學意義（P＞0．05）。

1．2 納入排除標準

1．2．1 納入標準 ⑴術前未合并其他部位惡性腫瘤；⑵術后病理證實為胰腺癌；⑶手術根治性切除腫瘤，術后生存期大于1個月，未發生圍術期并發癥；⑷有完整規范的術后病理報告及隨訪資料；⑸術前未接受介入治療、放化療；⑹無高血壓、糖尿病、腎炎、急慢性盆腔炎及子宮內膜異位癥等疾病，近期均未服影響前列腺素和血栓素代謝的藥物。

1．2．2 排除標準 ⑴合并其他系統嚴重疾病者；⑵未能完成隨訪者；⑶貧血及凝血功能障礙；⑷風濕及免疫系統疾病；⑸嚴重的肝腎功能疾病；⑹甲狀腺功能障礙；⑺因其他部位腫瘤進行過放化療治療者。

1．3 免疫組化染色 所有組織標本經石蠟包埋后作連續切片，厚度約為4mm，采用免疫組化鏈霉卵白素一生物素復合體法 (strep avidin－biotin complex，SABC法)染色，二氨基聯苯胺(diamionben zidene，DAB)顯色。 SHh、Ptch1 蛋白抗體、PV6000 通用型二抗以及SP試劑盒和DAB顯色盒均購自北京中杉金橋生物技術開發公司。以陽性片及PBS代替一抗分別作為陽性及陰性對照，高倍顯微鏡下觀察SHh、Ptch1蛋白的表達情況，具體染色步驟嚴格按照SP試劑盒說明書進行操作。

1．4 免疫組化判定標準 免疫組化結果判定：以在呈現清晰的棕黃色顆粒為陽性，按陽性細胞所占比例數分為： 染色強度分為－(陰性)、+(弱)、++(中度)、+++(強)； 染色范圍為－(0%～5%)、+(6%～25%)，++(26%～50%)、+++(＞50%)。 兩種蛋白陽性表達結果中，(一)歸為陰性表達組，(+)、(++)、(+++)歸為陽性表達組。

1．5 蛋白檢測方法及結果分析 Western blot檢測蛋白的相對表達量：冰上分離出組織，置于預冷的研缽中液氮研磨至粉末狀。按4：l（緩沖液：樣品蛋白）的比例加上樣緩沖液，每條泳道加20ul緩沖液稀釋的樣品，于60V電壓下跑膠，脫脂蛋白封閉2h， 羊抗 SHh、Ptch1 蛋白抗體 （濃度 1：1000），2h后加入二抗（濃度 1：200）。 Image pro plus 4．01 版本的專業圖像分析軟件 （購自上海精密儀器有限公司）進行圖像分析，SHh、Ptch1蛋白抗體購自羅氏檢測公司。

Western Blot結果分析：把各自的灰度值都用內參校正，得到蛋白的相對含量。

1．6 統計學方法 統計軟件采用SPSS 17．0，采用均數±標準差（±s）進行統計描述，兩組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；P值＜0．05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2．1 兩組組織標本中SHh、Ptch1蛋白的表達情況比較 病灶組、對照組的SHh蛋白表達陽性率分別為 68．00%、10．00%（P＜0．001）。 病灶組、 對照組的Ptch1 蛋白表達陽性率分別為 65．00%、6．00%（P＜0．001），見表 1、表 2。

表1 組織標本中SHh蛋白表達情況比較

表2 組織標本中Ptch1蛋白表達情況比較

2．2 兩組組織標 SHh、Ptch1蛋白印跡檢測結果病灶組SHh、Ptch1蛋白量與癌旁組相比差異具有統計學意義（P＜0．05），見表 3。

表3 SHh、Ptch1蛋白表達水平比較

2．3 胰腺癌組織標本中的SHh、Ptch1蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系 中低分化胰腺癌組織Shh、Ptch1蛋白平均表達率高于高分化胰腺癌組織Shh、Ptch1蛋白率，差異具有統計學意義（P＜0．05）；SHh、Ptch1 蛋白表達與患者年齡、性別、TNM分期、淋巴結轉移無關（P＞0．05），見表 4。

3 討論

胰腺癌的發病病因較為復雜，一般認為基因水平或者膽道系統基礎性疾病可能是促進胰腺癌發生的主要因素[5，6]。近年來，越來越多的研究顯示，基因調控或者分子生物學水平的改變，是促進胰腺癌發生的又一重要因素。分子譜相關水平的波動，能夠在影響到癌細胞的生物學特征、增強癌細胞細胞周期的調控，促進免疫逃逸、抑制機體的T淋巴細胞免疫反應等，進而協助腫瘤的浸潤或者轉移[7，8]。本次研究通過對于 Shh、Ptch1蛋白等生物學因子與胰腺癌發病的關系研究，特別是對于Shh、Ptch1蛋白與胰腺癌臨床病理特征的關系研究，能夠為臨床上胰腺癌的早期高危篩查提供潛在的分子參考。

SHh、Ptch1蛋白能夠增強胰腺腺體上皮細胞基因錯配的幾率，誘導癌基因的點突變的發生風險。SHh與其配體結合后，能夠誘導低氧環境，增加癌細胞的持續性DNA分裂的風險。SHh蛋白結構上包含的多個可結合的巰基結構，能夠促進患者體內的癌細胞膜表面的糖蛋白的激活，增加癌細胞內的腫瘤相關信號通路如AKT等的上調，增加癌細胞分化凋亡障礙[9，10]。Ptch1蛋白作為受體水平的糖蛋白分子，其與相關配體結合后，能夠增加胰腺細胞內的腫瘤易感分子的攜帶風險，導致癌細胞的早期T淋巴細胞的免疫逃逸，影響到機體的免疫監察作用[11，12]。部分研究揭示了hedgehog信號通路相關信號效應分子對于消化道系統惡性腫瘤或者生殖系統惡性腫瘤的發生的影響作用，認為SHh、Ptch1蛋白能夠顯著促進癌細胞對于臨近正常組織的浸潤及擴散的風險。

表4 胰腺癌組織Shh、Ptch1蛋白表達與臨床病理因素的關系

本研究通過免疫組化分析研究及蛋白定量水平的相關表達分析發現，SHh、Ptch1蛋白的表達陽性率或者表達濃度均明顯高于胰腺良性病變組或者對照組，差異具有統計學意義，提示SHh、Ptch1蛋白能夠在促進胰腺癌發生過程中發揮一定的作用，SHh、Ptch1蛋白在胰腺組織中的異常表達能夠通過影響到下列幾個方面的因素，導致胰腺腺體上皮細胞異型性及細胞核異常病變的發生[13，14]：⑴SHh蛋白對于胰腺腺體上皮細胞粘附能力的改變，不僅能夠促進粘附分子adherin 1的表達上升，同時能夠促進胰腺細胞間質成分的分解，為胰腺癌的早期臟器內部的轉移提供依據；⑵Ptch1蛋白通過對于AKT或者MAPK等信號通路的激活作用，能夠降低血管內皮鈣粘素的表達，提高癌細胞通過上皮間質轉換進行轉移的風險。趙一鳴等[15]研究者在分析了83例樣本量的胰腺癌患者的癌基因相關分子譜后發現，Ptch1蛋白或者其他hedgehog信號通路效應蛋白的表達濃度改變，是促進患者治療預后惡化、治療后的復發率的上升等結局發生的重要因素。部分研究者認為hedgehog信號通路相關效應分子的表達與胰腺癌患者的淋巴結浸潤或者臨床分期等主要臨床病理特征密切相關，但本次研究并未發現相關結論，考慮可能與樣本量的正態分布偏移有關，但也不排除與SHh、Ptch1蛋白等的表達確實難以影響到癌細胞對于淋巴結內皮組織的粘附等過程。在中低分化胰腺癌組織中，相關蛋白的表達陽性率較高，提示相關蛋白的異常表達與胰腺癌細胞的細胞分化障礙具有密切的關系，這可能與SHh、Ptch1蛋白等對于癌細胞分化誘導cyc－m的調控作用有關。

綜上所述，SHh、Ptch1蛋白在胰腺癌組織中高表達，并且與胰腺癌的細胞分化程度具有密切的關系。