NF-κB和IκB-a蛋白表達水平變化與老年癡呆發病相關性分析及作用機制分析

朱登玲，姜阿利，王慧峰，劉潘，徐鳳琴，王霞

(開封美寶空分醫院內科，河南 開封 475002)

老年癡呆病的最主要形式為阿爾茲海默病（Alzheimer's disease，AD），約占所有老年癡呆病患者比例的60%左右，此外本病具有不可逆性和隱匿性，對患者的正常生活和家庭均帶來了嚴重的負擔[1]。AD的發病機制較為復雜，通過AD發病機制以尋找治療和預防AD的新藥已成為現階段AD研究的重要方向。

核因子－κB （nuclear factor－kappa B，NF－κB）是具有促進基因轉錄功能的核蛋白因子，其激活和表達的上調可反映炎癥反應、血管損傷和細胞凋亡的嚴重程度。NF－κB在多類神經系統細胞中均存在分布，可作為信使傳遞突觸信號至核內而發揮調控基因轉錄的作用[2]。研究[3]發現癡呆大鼠海馬 NF－κB和抑制和轉錄因子－κB （inhibitor nu鄄clear factor－kappa B，IκB）關系密切。 故此，本研究深入探討了NF－κB和IκB－a蛋白表達水平變化與老年癡呆發病的相關性并討論其在臨床上應用的意義，現報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取我院確診的老年癡呆患者120例（AD組）、體檢正常的健康對象50例（對照組），收集時間2013年4月－2017年3月，臨床資料通過回顧患者的病歷記錄和病例報告獲得。

AD組，男性63例、女性57例，年齡48～85歲，平均年齡 67．2±13．1 歲；惡化程度：第一階段 37例，第二階段49例，第三階段34例。對照組，男性24例，女26例，年齡45～77歲，平均年齡63．1±12．2歲。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。

1．2 納入排除標準

1．2．1 納入標準[4]⑴各項檢測均確診為老年癡呆患者；⑵有完整規范的術后病理報告及隨訪資料；⑶無高血壓、糖尿病、腎炎等疾病。

1．2．2 排除標準 ⑴合并其他系統嚴重疾病者。⑵未能完成隨訪者。⑶貧血及凝血功能障礙；⑷風濕及免疫系統疾病；⑸嚴重的肝腎功能疾病。

1．3 免疫組化及蛋白質免疫印跡方法 免疫組化和蛋白質印跡法檢測兩組對象腦脊液中的NF－κB和 IκB－a蛋白表達情況。

免疫組化法：活檢患者大腦病變組織，繼續固定24h，常規石蠟切片，片厚5μm；選擇特異性抗體，通過免疫組織化學SP法定性分析NF－κB和IκB－a 蛋白表達情況；

蛋白印跡法：提取蛋白后BCA法檢測相關濃度，10ug單孔上樣進行凝膠電泳，轉膜后5%脫脂牛奶90min，25℃封閉；3%脫脂牛奶混勻一抗；4℃孵育過夜；一抗孵育后清洗3次，3%脫脂牛奶混勻二抗，IgG 濃度為 1：800；90min 28℃孵育后清洗 3次，顯影[5]。

1．4 免疫組化及蛋白質印跡判定標準[6]免疫組化結果判定：陰性對照用PBS代替一抗進行染色，結果做為陰性；以在呈現清晰的棕黃色顆粒為陽性，按陽性細胞所占比例數分為：染色強度分為－(陰性)、+(弱)、++(中度)、+++(強)； 染色范圍為－(0%～5%)、+(6%～25%)，++(26%～50%)、+++(＞50%)。兩種蛋白陽性表達結果中，(－)歸為陰性表達組，(+)、(++)、(+++)歸為陽性表達組。采用免疫印跡（Western blot）法測定各組織中 NF－κB 和 IκB－a 蛋白表達水平（灰度值＞15．0 為陽性）。

1．5 統計學方法 統計軟件采用SPSS 16．0，采用均數±標準差（±s）進行統計描述，兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析法；計數資料組間比較采用χ2檢驗；圖像分析系統(Image－pro Plus 6．0)計算 NF－κB 和 IκB－a 的積分光密度(Integral opticaldensity，IOD)。 P 值＜0．05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2．1 兩組組織標本中的 NF－κB 和 IκB－a 蛋白表達情況比較 AD組、對照組的NF－κB蛋白表達陽性率分別為 68．33%、18．00%（P＜0．001），見表 1。 IκB－a 蛋白陽性率分別為 20．00%、72．00%（P＜0．01），見表2。

表1 組織標本中的NF-κB蛋白表達情況比較

表2 組織標本中的IκB-a蛋白表達情況比較

2．2 NF－κB 和 IκB－a 蛋白印跡檢測結果 NF－κB在 AD 組的表達水平為 32．33±0．7， 明顯高于對照組的表達水平 （P＜0．05）；IκB－a 在 AD 組的表達水平為 15．22±0．3， 明顯低于對照組的表達水平 （P＜0．05）。 見表 3。

表3 Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平比較

2．2 老年癡呆患者 NF－κB 和 IκB－a 蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系 NF－κB和IκB－a蛋白表達率和相對含量在不同的年齡、性別、惡化程度中，差異具有統計學意義（P＜0．05），見表 4。

3 討論

目前，我國的老齡化趨勢日益嚴重，老年癡呆的發病率亦上升明顯，本病是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現為特征，病因迄今未明。老年癡呆是多種疾病因素相互作用而誘發，發病機制較為復雜，免疫假說、氧化應激假說、基因突變假說及膽堿功能低下假說均為當下較為流行的老年癡呆發病機制假說[7]。

表4 老年癡呆患者NF-κB和IκB-a蛋白表達與臨床病理學特征的關系

研究[8]認為氧化應激損傷是導致老年癡呆患者認知功能障礙的最關鍵的因素之一，老年癡呆可誘發腦內出現一系列炎癥和氧化應激反應，進而損傷神經元。NF－κB由氧化還原因子－1進行氧化還原調控的重要轉錄因子，可結合抑制蛋白I－κB家族而形成復合物進入細胞漿中[9]。經活化作用后I－κB與NF－κB出現解離而進入細胞核發揮基因表達的調節作用。資料[10]亦顯示I－κB和NF－κB與細胞內的炎癥反應關系密切，是一類重要的調節炎癥反應的信號通路。本研究中老年癡呆患者腦脊液中NF－κB和IκB－a蛋白表達明顯高于對照組的表達，差異具有統計學意義（P＜0．05）。 上述結果說明老年癡呆患者存在炎癥反應并提示NF－κB和IκB－a蛋白具有老年癡呆早期診斷的重要疾病指標的潛力。

研究[11]發現NF－κB普遍存在于真核細胞中，是一種具有序列特異性的二聚體結構，可通過胞漿將信息傳至細胞核而調節相關基因的表達。安靜狀態下，異源或同源二聚體NF－κB結合IκB－a蛋白而形成三聚體而以無活性狀態存在細胞質中。外界因素刺激細胞后可激活蛋白激酶IκK并在其作用磷酸化IκB，經過泛素－蛋白激酶降解后分離NF－κB，激活NF－κB并將其移位至細胞核內，與DNA接觸并形成環狀結構，發揮抑制或啟動基因轉錄的作用進而調節炎癥反應[12]。

老年癡呆患者NF－κB和IκB－a蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系結果顯示NF－κB和IκB－a蛋白表達與患者年齡、性別、和病情惡化階段有關，差異具有統計學意義（P＜0．05）。 上述結果說明者NF－κB和IκB－a蛋白表達與老年癡呆患者的病情發展關系密切。NF－κB具有神經損傷和保護的雙重作用，其中損傷作用主要取決于NF－κB產生的具體位置、產生量、活化信號（刺激物）、神經元所處位置和持續時間等多種因素。先前的研究[13]證實神經元突觸、突觸后及胞體致密層具有活性的NF－κB具有將突觸信息傳送至細胞核中的信使功能，認為NF－κB活化是導致神經元等許多類型細胞凋亡的主要機制之一。最新的研究[14，15]顯示NF－κB發揮神經保護作用的機制可分為以下幾點：⑴誘導錳過氧化物歧化酶的轉錄；⑵促進神經元凋亡抑制蛋白MAP的表達；⑶抑制谷氨酸受體亞單位的表達；⑷穩定細胞內鈣和增加鈣結合蛋白的轉錄； ⑸誘導凋亡抑制因子 Bcl－2、Bcl－xl的表達。經過研究我們認為對老年癡呆的治療可通過調節 Ref－1－NF－κB－IκB 氧化還原通路為研究點，進而調節神經保護作用，提高老年癡呆患者的記憶能力，但具體結果還需要進一步研究證實。

綜上所述，NF－κB 和 IκB－a 蛋白表達與老年癡呆發病具有密切的聯系，有望成為檢測老年癡呆的指標。