呼吸機相關性肺炎患者下呼吸道標本檢出的粘質沙雷菌β-內酰胺酶檢測及同源性分析

陳曉香，許青霞，盛家和

(鄭州大學附屬腫瘤醫院檢驗科，河南 鄭州450000)

呼吸機相關性肺炎 (ventilator-associated pneumonia，VAP)是重癥醫學科(ICU)機械通氣患者最常見的感染性疾病之一，可導致患者住院時間和ICU留治時間延長，抗菌藥物使用增加，重癥患者病死率增加[1]，因此遏制VAP已成為醫療機構需要迫切解決的問題[2]。目前，常引起呼吸機相關性肺炎的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等多有文獻論述[1，3]，但粘質沙雷菌引起呼吸機相關性肺炎鮮有報道，故本文連續多年收集相關患者下呼吸道標本分離的粘質沙雷菌，研究其藥物敏感性特征、主要β－內酰胺酶的基因型及是否存在粘質沙雷菌在患者之間的傳播，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑 全自動細菌鑒定和藥敏分析儀為美國BD公司PhoenixTM－100，PCR預混液、細菌DNA提取試劑盒、引物合成等來自上海生物工程技術有限公司，脈沖場凝膠電泳儀及凝膠成像系統購自美國Bio－Rad公司，PCR擴增儀購自美國ABI公司，E－test試紙條購自安圖生物。

1．2 菌株來源及其鑒定和藥敏 2015年3月1日至2017年3月1日，連續收集我院重癥監護病房明確診斷為呼吸機相關性肺炎患者下呼吸道標本分離的粘質沙雷菌。下呼吸道標本的臨床檢驗方法均嚴格參照《臨床檢驗操作規程》[4]和《下呼吸道感染細菌培養操作指南》[5]。呼吸機相關性肺炎的診斷標準遵照 《中華醫學會重癥醫學分會的診療指 南 》 和 規 范[1，6]。 質 控 菌 株 為 大 腸 埃 希 菌ATCC25922、沙門菌H9812。所有粘質沙雷菌的鑒定和最小抑菌濃度測定均使用PhoenixTM－100，并用E－TEST條驗證，判讀標準均參考CLSI2016年1 月 M100－S26[7]。

1．3 β－內酰胺酶基因型確證實驗 試劑盒提取菌株基因組DNA為模板，引物及擴增條件均參考相關文獻[8]，詳見表1。其余β內酰胺酶基因blaTEM、blaSHV、blaFOX、blaOXA、blaCTX－M－2、blaCTX－M group 8/25、blaMOX、blaDHA、blaCMY1－23、blaACT－1和blaMIR等擴增條件、引物均參考文獻[9]。如擴增陽性，產物直接純化后測序，結果在GenBank上比對以確定基因型。

1．4 脈沖場凝膠電泳及指紋圖譜聚類分析 菌株在LB肉湯中過夜震蕩，菌液和2%的低熔點膠灌模，然后使用0．8g/L蛋白酶K消化24h，后使用TE洗膠及XbaⅠ37℃酶切過夜，并埋入1%瓊脂糖凝膠電泳，切換時間為2．16－63．8s，電場強度是6V/cm，電場夾角是 120°，電泳時間是 18．5h，最后用溴化乙錠染色紫外燈成像，判讀參考Tenover等人的標準[10]。

2 結果

2．1 菌株及藥敏 共收集粘質沙雷菌67株。藥敏結果顯示，粘質沙雷菌對亞胺培南和美羅培南的敏感率均為100%，其次哌拉西林/他唑巴坦、環丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶、復方新諾明等 的 敏 感 率 分 別 為 97．59% 、96．18% 、93．27% 、85．07%、82．13%，但對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢呋辛、呋喃妥因等敏感率均低于50%。其中對頭孢他啶和頭孢噻肟耐藥的10株粘質沙雷菌具體耐藥譜見表2。

2．2 β－內酰胺酶表型和基因型確證實驗 ESBLs表型實驗證實，此10株粘質沙雷菌β－內酰胺酶表型均為陽性。擴增顯示，在約561bp處均有清晰條帶，測序比對的結果顯示，均為CTX－M－14（詳見圖1），DNA 序列一致率均為 100%；1－5、7、10 在約895bp處有清晰條帶，測序證實均為CMY－1（詳見圖2），DNA序列一致率均為100%。其余均為陰性。

圖1 CTX-M-14基因PCR擴增電泳圖（M為Marker）

表1 PCR擴增引物

表2 10株粘質沙雷菌的最小抑菌濃度（μg/ml）

2．3 同源性分析 菌株 1、2、5的條帶的差異小于兩條，表明此三株菌具有同源性，菌株3和4具有完全相同的條帶，表明兩株具有同源性，其余菌株均沒有同源性（詳見圖3）。

圖2 CMY-1基因PCR擴增電泳圖（M為Marker）

圖3 Xbal酶切后的脈沖場凝膠電泳圖

3 討論

粘質沙雷菌通常存在水和土壤中，被認為是院內感染的重要病原菌，可引起肺部、血流和泌尿系統感染等，嚴重的會引起院內感染的爆發，特別是在重癥監護病房。從2015年3月1日至2017年3月1日，我院發生多起呼吸機相關性肺炎，其下呼吸道標本均分離出粘質沙雷菌。藥敏情況統計表明，我院下呼吸道分離的粘質沙雷菌沒有碳青霉烯類抗生素耐藥株，對三代頭孢菌素、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等都具有較好的敏感率，優于2016年CHINET統計的數據[11]；但對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢呋辛、呋喃妥因等耐藥率較高，此與CHINET數據基本一致[11]。

β－內酰胺酶的檢測表明，有10株粘質沙雷菌對頭孢他啶和頭孢噻肟耐藥，均檢出CTX－M－14型超廣譜β－內酰胺酶。CTX－M是一種質粒介導的頭孢菌素酶，包含多個快速增長的亞群，具有臨床重要的意義[12]。CTX－M基因在世界各地的不同菌株均有檢出，但不同地區流行的ESBLs的基因型或亞型有一定差異，如歐洲以CTX－M－1群為主，亞洲國家以 CTX－M－9 群為主[12，13]。 CTX－M－14 是CTX－M－9群的一種，在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細菌中均有檢出。

除了CTX-M型超廣譜β內酰胺酶外，還發現了有七株細菌同時產CMY-1型AmpC酶。CMY-1在國內極少有文獻報道，僅國外有限的文獻報道多在家禽和寵物分離的粘質沙雷菌CMY-1[14]，另有韓國的文獻報道，367株粘質沙雷菌中，CMY-1的檢出率為2.5%[15，16]，其他細菌包括腸桿菌科的細菌中，極少檢出CMY-1。本文在臨床標本中，連續在多株粘質沙雷菌中，發現CMY-1型AmpC酶基因，其基因周圍序列的特征對于研究CMY-1基因的進化規律或重組過程有著重要的意義。

同源性分析的結果顯示，菌株1、2和5具有典型的同源性。追蹤其病歷發現，此三株細菌均來自我院ICU病區三位不同的患者，均為2016年8月份入院，分別接受了膀胱腫瘤切除術、陰莖癌腹股溝淋巴結清掃術和直腸癌術后放療后入住ICU病區，均為機械通氣后48h出現體溫升高，白細胞增多等現象，最高體溫至39℃左右，WBC均在20.5×109/L以上，下呼吸道標本涂片低倍鏡下每視野WBC大于25個，伴隨大量的革蘭陰性桿菌并吞噬，鑒定為粘質沙雷菌。菌株3和4為2016年5月份入院，均為多器官功能衰竭入住ICU病區，去除呼吸機后4-5h出現感染癥狀，下呼吸道標本也分離獲得粘質沙雷菌。結果表明，同時產CMY-1和CTX-M-14的粘質沙雷菌1、2和5可能是我院傳播的克隆株，而菌株3和4可能是我院傳播的另一克隆株。追蹤以上克隆株傳播的路徑有待進一步研究。

總之，通過本文的研究發現，我院引起呼吸機相關性肺炎的粘質沙雷菌對碳青霉烯類、氨基糖苷類和部分抗生素類仍保持較高的敏感性，但少部分菌株可通過攜帶CTX-M型超廣譜β內酰胺酶或CMY-1型AmpC酶導致對三代頭孢耐藥；尤為重要的是，部分患者存在院內粘質沙雷菌克隆傳播的可能，因此合理使用抗生素，做好院內多重耐藥菌的防控極其重要。