CD47抗體對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌細胞損傷的保護作用

戴有金　付鶴玲　鮑丹　鄭媛　侯道榮

[摘要] 目的 觀察CD47抗體對異丙腎上腺素（ISO）誘導大鼠原代心肌細胞損傷的保護作用。 方法 分離培養40只1～3日齡的SD大鼠心肌細胞，使用ISO誘導原代大鼠心肌細胞損傷模型。采用隨機數字表法將大鼠心肌細胞分為正常對照組（Control組）、模型組（ISO組）、治療組（Anti-CD47+ISO組）。Control組，心肌細胞常規培養基培養；ISO組，常規培養基培養，加入ISO（10-5 mol/L）繼續培養48 h；Anti-CD47+ISO組，常規培養基加入CD47抗體（7 μg/mL）培養12 h后，加入ISO（10-5 mol/L）繼續培養48 h。測定培養細胞上清液乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量；使用Annexin-V與PI雙染法及流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率；超氧化物陰離子熒光探針（DHE）染色檢測心肌細胞活性氧（ROS）水平；Western blot檢測心肌細胞CD47、Bcl-2和Bax蛋白的表達。 結果 與Control組比較，ISO組心肌細胞的凋亡率明顯升高（P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組可顯著降低細胞凋亡率（P < 0.01）。與Control組比較，ISO組LDH、CK、MDA和ROS水平顯著升高（P < 0.01），SOD和NO水平顯著降低（P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組SOD和NO水平顯著提高（P < 0.01），LDH、CK、MDA以及ROS水平顯著降低（P < 0.01）。Western blot結果顯示，與Control組比較，ISO組CD47和Bax表達顯著升高（P < 0.05、P < 0.01），Bcl-2表達顯著降低（P < 0.01）；相比于ISO組，Anti-CD47+ISO組CD47和Bax表達明顯降低（P < 0.01），Bcl-2表達明顯升高（P < 0.05）。 結論 CD47抗體可能通過抑制ROS的產生、調節Bcl-2/Bax蛋白表達比例來抑制心肌凋亡，從而對ISO誘導的大鼠原代心肌細胞損傷產生保護作用。

[關鍵詞] CD47抗體；心肌細胞；異丙腎上腺素；抗氧化；抗凋亡

[中圖分類號] R542.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（b）-0013-06

[Absract] Objective To investigate the protective effect of CD47 antibody on Isoproterenol （ISO） induced primary cardiomyocytes injury in rats. Methods The myocardial cells were isolated from 40 SD rats （1-3 days old）. The model of primary myocardial cells injury was induced by ISO. The myocardial cells of rats were divided into normal control group （control group）， model group （ISO group） and treatment group （Anti-CD47+ISO group） by random number table. In control group， myocardial cells were cultured in the conventional medium； in ISO group， the conventional culture medium was added with ISO （10-5 mol/L） for 48 h； in Anti-CD47+ISO group， CD47 antibody （7 μg/mL） was added to the conventional culture medium for 12 h， followed by ISO （10-5 mol/L） for another 48 h. Cultured supernatants were collected to measure lactic dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK）， superoxide dismutase （SOD）， malonadehyde （MDA）， nitric oxide （NO）； the myocardial apoptosis rate was detected using Annexin-V and PI double staining and flow cytometry； dihydroethidium （DHE） staining was used to detecte reactive oxygen species （ROS） in cardiomyocytes； the expression of CD47， Bcl-2 and Bax was detected by Western blot. Results Compared with the control group， the myocardial cells apoptosis rate in ISO group was significantly increased （P < 0.01）； compared with the ISO group， the cardiacmyocyte apoptosis rate in Anti-CD47+ISO group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the control group， the levels of LDH， CK， MDA and ROS in ISO group were significantly increased （P < 0.01）， the levels of SOD and NO were significantly decreased （P < 0.01）； compared with the ISO group， the levels of SOD and NO in Anti-CD47+ISO group were significantly increased （P < 0.01） and the levels of LDH， CK， MDA and ROS were significantly decreased （P < 0.01）. The results of Western blot showed that compared with the control group， the expression of CD47 and Bax in ISO group was increased significantly （P < 0.05， P < 0.01）， the expression of Bcl-2 in ISO group was decreased significantly （P < 0.01）； compared with ISO group， the expression levels of CD47 and Bax in Anti-CD47+ISO group were decreased significantly （P < 0.01）； the expression level of Bcl-2 in ISO group was increased significantly （P < 0.05）. Conclusion CD47 antibody may inhibit myocardial apoptosis by inhibiting the production of ROS and regulating the expression rate of Bcl-2/Bax protein， thus playing a protective effect on ISO-induced primary myocardial cell injury in rats.

[Key words] CD47 antibody； Myocardial cells； Isoproterenol； Anti-oxidant； Anti-apoptotic

缺血性心臟病是全球發病率和病死率最高的心臟疾病。心肌缺血最終引起心肌梗死，是一種急性心肌損傷，其原因是缺乏足夠的血液流向心肌[1]。氧化應激、心肌凋亡與心血管疾病包括心肌缺血和心肌肥厚有重要關系[2]。盡管臨床護理改進，抗血小板、抗凝治療和冠狀動脈手術干預等治療方法被使用，心肌缺血引起心肌梗死仍然是世界范圍內死亡的主要原因[3]。

眾所周知，β腎上腺素能受體介導的信號通路在調節正常心臟功能上發揮重要作用，然而β腎上腺素能受體的過量激活會導致心臟功能紊亂，其機制是氧化應激的增加誘導了心肌細胞的凋亡[4]。異丙腎上腺素（ISO）是一種合成的兒茶酚胺和β腎上腺素能受體激動劑，它能產生嚴重的心肌應激和梗死，會導致心肌依從性降低，心肌舒張和收縮功能抑制[5]。ISO引起的實驗動物心臟病理學和形態學改變與人類缺血性心肌梗死的疾病特征極為相似[5]。有研究表明，使用CD47抗體阻斷CD47信號，或者使用CD47敲除小鼠，可以減輕肝臟和心臟缺血/再灌注損傷，促進組織存活[6-7]。然而，CD47抗體對ISO誘導的大鼠心肌細胞損傷的作用鮮見報道。本研究擬使用ISO誘導大鼠心肌細胞損傷模型，從抗氧化及抗凋亡等方面探討CD47抗體對ISO誘導的心肌損傷的作用，旨在為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生1～3 d的SPF級Sprague-Dawley（SD）乳大鼠40只，雌雄不限，購于南京醫科大學醫藥實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（蘇）2016-0002。動物自由飲食并置于恒定環境[溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，12 h晝/夜循環光照]下飼養。

1.2 主要試劑

ISO（5984-95-2）和二甲基亞砜（DMSO，D8418）購自美國Sigma公司；DMEM高糖（11995-065）和胰酶（1869828）購自美國Gibco公司；超氧化物陰離子熒光探針（DHE，1890512）購自美國Invitrogen公司；乳酸脫氫酶（LDH，A020-1）、肌酸激酶（CK，A032）、超氧化物歧化酶（SOD，A001-1）和丙二醛（MDA，A003-1）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；噻唑藍（MTT）購自美國ENZO公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（556547）購自美國BD Biosciences公司；CD47抗體（sc-53050）、Bax抗體（sc-7480）和Bcl-2抗體（sc-23960）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；GAPDH抗體（5174）購自美國Cell Signal Technology公司。

1.3 主要儀器

普通細胞培養箱（HERACELL 150i），美國Thermo Scientific公司；細胞培養板，美國Corning公司；200目濾網（15-1070），Biologix公司；96孔多功能酶標檢測儀（Eon），美國BioTeK公司；流式細胞儀（BD FACSVerse），美國BD Biosciences公司。

1.4 方法

1.4.1 乳鼠心肌細胞分離和培養 心肌細胞分離采用酶消化、差速貼壁法[8]。取1～3 d SD大鼠，使用75%乙醇浸泡消毒1 min后，取出心臟，去除心房；DPBS沖洗3次后剪碎心室肌；用0.125%胰酶多次消化成單細胞懸液；細胞懸液經200目濾網過濾，離心（1500 r/min，5 min，r = 13.7 cm）收集沉淀；用含10%胎牛血清培養基重懸細胞后接種于培養瓶中。37℃、5%CO2，孵箱中培養90 min；吸出心肌細胞培養液離心（非心肌細胞先貼壁），加入培養液（90% DMEM、10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL），以6×105/mL接種到6孔板，37℃，5%CO2，孵箱中培養；48 h后心肌細胞貼壁，更換培養基，以后每2天換液1次，培養3～4 d后用于實驗。

1.4.2 分組與干預 使用隨機數字表法將大鼠原代心肌細胞隨機分為正常對照組（Control組）、模型組（ISO組）和治療組（Anti-CD47+ISO組）。Control組，心肌細胞常規培養基培養；ISO組，常規培養基培養，加入ISO（10-5 mol/L）繼續培養48 h[9]；Anti-CD47+ISO組，常規培養基加入CD47抗體（7 μg/mL）培養12 h后[10]，加入ISO（10-5 mol/L）繼續培養48 h。所有實驗重復3次。

1.5 觀察指標

1.5.1 心肌細胞活力測定 將心肌細胞按密度為105/mL接種于96孔板中，每組包含5個重復孔，按Control組、ISO組、Anti-CD47+ISO組分別抽取100 μL加入到對應的培養基中培養48 h，再于每孔加入0.5% MTT溶液10 μL，靜置4 h，保留心肌細胞，并用PBS液漂洗2次，在每孔內入150 μL DMSO，在沒有細胞的空白孔中加DMSO培養液，設為對照孔。振蕩10 min后，在酶標儀中測量各孔的吸光度值（570 nm）。細胞存活率=（樣品-空白）/（對照-空白）×100%。

1.5.2 心肌細胞凋亡檢測 使用AnnexinV-FITC/PI試劑盒檢測心肌細胞凋亡。心肌細胞接種于25 cm2細胞培養瓶中，分組處理結束后，收集培養液并離心后，低溫保存。細胞用DPBS清洗3次，用0.25%胰酶消化，收集細胞，離心后用AnnexinV-FITC結合液重懸，制成單細胞懸液，加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PI）室溫避光孵育10 min后，加入300 μL 1×buffer終止反應，混勻，流式細胞儀檢測，數據分析使用FlowJo10.0.2軟件。

1.5.3 LDH、CK、SOD、MDA和NO水平檢測 收集各組細胞上清液，按照試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測LDH、CK、SOD、MDA和NO水平。

1.5.4 活性氧（ROS）檢測 細胞使用DPBS洗滌3次；加入DHE（10 μm），37℃避光孵育30 min；DPBS洗滌3次后熒光顯微鏡拍照。

1.5.5 Western blot 采用蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒進行蛋白定量，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離、轉膜。5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉3 h后，分別加入Anti-CD47抗體、Anti-Bax抗體、Anti-Bcl-2抗體和Anti-GAPDH抗體。4℃孵育過夜，1×TBST洗3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育2 h，1×TBST洗3次，增強化學發光法顯色，凝膠成像系統拍照。使用Image J軟件定量，使用GraphPad Prism軟件作圖。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0對所得數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌細胞存活率比較

大鼠心肌細胞ISO處理明顯增加了心肌細胞死亡，與Control組[（98.21±2.15）%]比較，ISO組[（48.59±3.68）%]心肌細胞存活率明顯下降（P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組[（77.85±5.43）%]心肌細胞存活率顯著升高（P < 0.01）。

2.2 各組心肌細胞上清液中LDH、CK的含量比較

ISO組心肌細胞CK和LDH水平明顯高于Control組（P < 0.01）；Anti-CD47+ISO組CK和LDH水平顯著低于ISO組（P < 0.01）。見表1。

2.3 各組心肌細胞上清液中SOD、MDA和NO的含量比較

ISO組培養基上清MDA水平明顯高于Control組（P < 0.01），SOD和NO水平明顯低于Control組（P < 0.01）；Anti-CD47+ISO組培養基上清MDA水平顯著低于ISO組（P < 0.01），SOD和NO水平顯著高于ISO組（P < 0.01）。見表2。

2.4 各組細胞凋亡比例比較

與Control組比較，ISO組的細胞早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率均顯著增高（P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組的細胞早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率則明顯下降（P < 0.01）。見表3。

2.5 CD47抗體對ISO誘導的心肌細胞ROS產生的影響

為了檢測Anti-CD47抗體是否可以減少大鼠心肌細胞ROS的產生，本研究使用DHE對細胞內產生的O2-進行染色（圖1）。心肌細胞ISO處理明顯使細胞產生更多的ROS；與Control組比較，ISO組ROS熒光更強；而CD47抗體封閉顯著減少細胞ISO處理后ROS的產生；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組ROS熒光明顯減弱。

2.6 CD47抗體對ISO誘導的心肌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的影響

為了確定CD47下調對ISO誘導的心肌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的影響，本研究檢測了CD47、Bcl-2和Bax的蛋白表達（圖2A）。定量結果顯示，ISO組Bcl-2表達較Control組明顯下降（P < 0.01），CD47和Bax表達明顯上升（P < 0.05、P < 0.01）；與ISO組比較，Anti-CD47+ISO組Bcl-2表達顯著上升（P < 0.01），CD47和Bax表達顯著降低（P < 0.01）（圖2B）。

3 討論

ISO為β受體激動劑，作用于支氣管β腎上腺素受體，使支氣管平滑肌松弛；作用于心肌β腎上腺素受體，增強心肌收縮力，縮短收縮期和舒張期。大劑量ISO則通過自身氧化而導致大量自由基的急劇生成和聚集，從而導致心肌缺血、缺氧，促使心肌結構及功能嚴重損傷，最終導致心肌細胞壞死，常用于心肌缺血損傷模型的誘導[11]。ISO誘導的急性心肌缺血損傷特征在人與大鼠上較為相似，故這種簡便易行的方法常被國內外用于復制心肌缺血引起的心肌梗死實驗動物疾病模型[12]。

CD47是一種具有五個跨膜域的蛋白質，在大多數細胞類型中廣泛表達并參與免疫反應[13]。有研究表明在缺血狀態下，CD47在血管細胞中顯著上調[14]；CD47下調可以保護心臟壓力，緩解心臟衰竭[15]；CD47還能減輕心肌梗死和缺血/再灌注損傷[16-17]。

通過細胞凋亡率以及細胞培養基中CK、CK-MB、AST、LDH含量的測定能夠反映心肌細胞的損傷程度[7]。當組織壞死時，LDH及CK即可大量釋放入血，其在血液中的活性隨之升高[18]。本研究中ISO組心肌細胞的凋亡率以及培養基中CK和LDH的含量顯著高于Control組，說明，ISO使心肌細胞發生嚴重損傷；CD47抗體使體外培養的大鼠心肌細胞CD47表達下調；具有抗氧化和減輕ISO的心肌細胞損傷的作用。

研究認為ISO引起的心肌缺血損傷與細胞內Ca2+超載和自由基大量產生有關。SOD、CAT以及GSH-Px等多種抗氧化酶組成了體內對抗自由基氧化損傷的防御系統，對體內氧化/抗氧化平衡的維持具有重要的意義[19]。細胞氧化應激主要由ROS介導，能夠造成細胞內SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化物質被大量消耗，進而引起生物膜中脂質成分發生氧化并生產MDA[20]。正常情況下，ROS可被體內的抗氧化酶清除從而使細胞免受ROS的氧化損傷。當機體處于組織細胞缺血、缺氧時，ROS的清除系統功能會降低或喪失，從而造成細胞損傷[21]。氧化應激也是缺血/再灌注的主要病理表現[22]。本研究中，心肌細胞經ISO處理使氧化應激增加，并且降低了抗氧化能力。下調CD47不僅減少了超氧化物的產生，而且增強了心肌細胞SOD的抗氧化能力；CD47抗體還減少了ISO處理心肌細胞MDA的產生。這些結果說明下調CD47可減少ROS的產生以及增加抗氧化SOD酶活性。此外，ISO處理導致細胞培養基NO濃度的下降，CD47抗體會使NO濃度升高，這提示我們CD47抗體對心肌細胞的保護作用很可能通過增加NO的產生而實現。NO是生物活性氣體，其作為血管內皮舒張因子，是體內重要的內源性細胞保護物質，可改善動脈內皮功能，舒張動脈血管，清除氧自由基，減輕心肌梗死和抑制凋亡，從而保護心肌細胞[22]。

心肌細胞凋亡是ISO誘導心肌損傷的標志，心肌細胞凋亡或細胞凋亡的過程會導致心肌功能衰退，最終引起慢性心肌病和末期心臟衰竭，導致預后惡化[23]。氧化應激在心血管疾病的發生發展過程發揮著重要作用，既可直接損傷細胞DNA誘導凋亡，還可以通過激活線粒體途徑等間接方式介導細胞凋亡。氧化應激介導的心肌細胞凋亡是心肌梗死發病機制中的重要環節之一[19]。本研究中ISO引起心肌細胞的存活率急劇下降，Bcl-2表達減少，Bax表達增加；抗體封閉CD47則會顯著抑制細胞的凋亡，Bcl-2表達增加，Bax表達減少。Bcl-2家族是在B細胞濾泡性淋巴瘤中發現的抗細胞凋亡基因，按其功能可分為抗凋亡的Bcl-2亞族和促凋亡的Bax亞族，心肌損傷會導致Bax蛋白表達增多[24]。在細胞凋亡信號轉導途徑中，Bcl-2家族成員的構成比例是凋亡調控的關鍵因素，Bcl-2/Bax在細胞凋亡過程中具有重要意義[24]。本研究結果提示，CD47抗體可能通過調節Bcl-2/Bax細胞凋亡蛋白比例，抑制細胞凋亡，保護缺血心肌。

綜上所述，本研究結果提示，氧化應激在ISO誘導的心肌細胞損傷病理中發揮重要作用；CD47抗體可以通過調節ISO誘導損傷后心肌細胞的氧化應激作用，增加心肌細胞的存活率，抑制心肌細胞凋亡。CD47抗體在保護ISO誘導的急性心肌損傷上具有較顯著的作用，有望應用于臨床治療。

[參考文獻]

[1] Wang SB，Tian S，Yang F，et al. Cardioprotective effect of salvianolic acid a on isoproterenolinduced myocardial infarction in rats [J]. Eur J Pharmacol，2009，615（1-3）：125-132.

[2] Radhiga T，Rajamanickam C，Sundaresan A，et al. Effect of ursolic acid treatment on apoptosis and DNA damage in isoproterenol-induced myocardial infarction [J]. Biochimie，2012，94（5）：1135-1142.

[3] Morrison A，Li J. PPAR-γ and AMPK-advantageous targets for myocardial ischemia/reperfusion therapy [J]. Biochem Pharmacol，2011，82（5）：195-200.

[4] Zhang GX，Kimura S，Nishiyama A，et al. Cardiac oxidative stress in acute and chronic isoproterenol-infused rats [J]. Cardiovasc Res，2005，65（1）：230-238.

[5] Patel V，Upaganlawar A，Zalawadia R，et al. Cardioprotective effect of melatonin against isoproterenol induced myocardial infarction in rats：a biochemical，electrocardiographic and histoarchitectural evaluation [J]. Eur J Pharmacol，2010，644（1-3）：160-168.

[6] Xiao ZY，Banan B，Jia J，et al. CD47 blockade reduces ischemia/reperfusion injury and improves survival in a rat liver transplantation model [J]. Liver Transpl，2015，21（4）：468-477.

[7] Wang HB，Yang J，Ding JW，et al. RNAi-Mediated Down-Regulation of CD47 Protects against Ischemia/Reperfusion-Induced Myocardial Damage via Activation of eNOS in a Rat Model [J]. Cell Physiol Biochem，2016，40（5）：1163-1174.

[8] 王冰梅，王姝，張蓮，等.芍藥苷對原代培養大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用[J].國際老年醫學雜志，2016，37（3）：103-106.

[9] Li J，Peng J，Wang C，et al. Calcitonin gene-related peptide suppresses isoprenaline-induced cardiomyocyte apoptosis through regulation of microRNA-1 and microRNA-133a expression [J]. J Cent South Univ（Med Sci），2011， 36（10）：964-971.

[10] Wang Y，Yin C，Feng L，et al. Ara-C and anti-CD47 antibody combination therapy eliminates acute monocytic leukemia THP-1 cells in vivo and in vitro [J]. Genet Mol Res，2015，14（2）：5630-5641.

[11] Yates JC，Beamish RE，Dhalla NS. Ventricular dysfunction and necrosis produced by adrenochrome metabolite of epinephrine：relation to pathogenesis of catecholamine cardiomyopathy [J]. Am Heart J，1981，102（2）：210-221.

[12] Soejima Y，Hu Q，Krafft PR，et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation by inhibiting matrix metalloproteinases in focal cerebral ischemia in rats [J]. Exp Neurol，2013，247（3）：737-743.

[13] Soto-Pantoja DR，Miller TW，Pendrak ML，et al. CD47 deficiency confers cell and tissue radioprotection by activation of autophagy [J]. Autophagy，2012，8（11）：1628-1642.

[14] Bauer PM，Bauer EM，Rogers NM，et al. Activated CD47 promotes pulmonary arterial hypertension through targeting caveolin-1 [J]. Cardiovasc Res，2012，93（4）：682-693.

[15] Sharifi-Sanjani M，Shoushtari AH，Quiroz M，et al. Cardiac CD47 drives left ventricular heart failure through Ca2+-camkii-regulated induction of hdac3 [J]. J Am Heart Assoc，2014，3（3）：e000670

[16] Sezaki S，Hirohata S，Iwabu A，et al. Thrombospondin-1 is induced in rat myocardial infarction and its induction is accelerated by ischemia/ reperfusion [J]. Exp Biol Med，2005，230（9）：621-630.

[17] Rogers NM，Thomson AW，Isenberg JS. Activation of pare-nchymal cd47 promotes renal ischemia-reperfusion injury [J]. J Am Soc Nephrol，2012，23（9）：1538-1550.

[18] Chen H，Xu Y，Wang J，et al. Baicalin ameliorates isoproterenol-induced acute myocardial infarction through iNOS，inflammation and oxidative stress in rat [J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（9）：10139-10147.

[19] Khatua TN，Padiya R，Karnewar S，et al. Garlic provides protection to mice heart against isoproterenol induced oxidative damage：role of nitric oxide [J]. Nitric Oxide，2016，27（1）：9-17.

[20] Yang M，Chen J，Zhao J，et al. Etanercept attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury by decreasing inflammation and oxidative stress [J]. PLoS One，2014，9（9）：e108024.

[21] Meng X，Sun G，Ye J，et al. Notoginsenoside R1-mediated neuroprotection involves estrogen receptor-dependent crosstalk between Akt and ERK1/2 pathways：a novel mechanism of Nrf2/ARE signaling activation [J]. Free Radic Res，2014，48（4）：445-460.

[22] Kurian GA，Rajagopal R，Vedantham S，et al. The role of oxidative stress in myocardial ischemia and reperfusion injury and remodeling：revisited [J]. Oxid Med Cell Longev，2016，2016：1656450.

[23] Shuang W，Shiying F，Fengqi L，et al. Use of a high thoracic epidural analgesia for treatment of end-stage congestive heart failure secondary to coronary artery disease：effect of htea on chf [J]. Int J Cardiol，2008，125（2）：283-285.

[24] Volkmann N，Marassi FM，Newmeyer DD，et al. The rheostat in the membrane：Bcl-2 family proteins and apoptosis [J]. Cell Death Differentiation，2014，21（2）：206-215.

（收稿日期：2017-12-27 本文編輯：張瑜杰）