血必凈聯合常規治療對膿毒癥患者生存質量及血清Treg蛋白表達的影響

陳明科　朱永　李娜　謝曉紅

[摘要] 目的 探討血必凈注射液聯合常規治療對膿毒癥患者生存質量及調節性T細胞（Treg）蛋白表達的影響。方法 選取海南省人民醫院2013年10月～2016年10月住院治療膿毒癥患者120例，按照隨機數字表分為對照組和治療組。其中對照組58例，予常規治療；治療組62例，采用常規治療聯合靜脈注射血必凈注射液。觀察兩組患者治療后的生存質量及治療前后血清Treg水平變化及Treg蛋白表達情況。 結果 治療后對照組患者生存質量12例提高，25例穩定，21例下降；治療組患者生存質量45例提高，15例穩定，2例下降。兩組患者生存質量比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。兩組患者治療前血清Treg水平及其蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；而治療后兩組血清Treg水平及其蛋白表達量較本組治療前顯著下降，治療組患者血清Treg水平及其蛋白表達量均低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。對照組患者生存率顯著低于治療組，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 血必凈聯合常規治療能有效提高膿毒癥患者的生存質量，抑制血清Treg蛋白表達可能是其作用機制之一，進而調節免疫功能發揮作用。

[關鍵詞] 血必凈注射液；常規治療；調節性T細胞；膿毒癥

[中圖分類號] R459 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（b）-0100-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Xuebijing Injection combined with conventional treatment on the quality of life and the protein expression of regulatory T cell （Treg） in sepsis patients. Methods A total of 120 patients with sepsis admitted to Hainan General Hospital from October 2013 to October 2016 were selected and divided into control group and treatment group according to random number table method， 58 cases in the control group were treated with conventional treatment， 62 cases in the treatment group were treated with conventional treatment combined with Xuebijing Injection intravenous injection. The quality of life， the level of serum Treg and the expression of Treg protein between the two groups after treatment were observed. Results After treatment， 12 cases′ quality of life improved， 25 cases were stable and 21 cases declined in the control group； 45 cases′ quality of life improved， 15 cases were stable and 2 cases declined in the treatment group； the difference between the two groups was statistically significant （P < 0.05）. Before treatment， the level of serum Treg and the expression protein of Treg between the two groups had no significant difference （P > 0.05）. After treatment， the level of serum Treg and the expression protein of Treg in the two groups were lower than those before treatment， and the indices in the treatment group were significant lower than those in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The survival rate of the control group was remarkably lower than that of the treatment group， and the difference was significant （P < 0.05）. Conclusion Xuebijing Injection combined with conventional treatment can effectively improve the quality of life of patients with sepsis， and inhibit the expression of serum Treg protein， that may be one of its action mechanisms， so as to regulate the immune function.

[Key words] Xuebijing Injection； Conventional treatment； Regulatory T cell； Sepsis

膿毒癥作為巨大的健康隱患，全球患者達數百萬人，重癥醫學科因膿毒癥死亡患者比例較大，并且發病率呈日益上升的趨勢。嚴重膿毒癥和感染性休克患者的死亡率高達25%～50%[1]。作為危及生命的疾病，膿毒癥需要高科技醫療設備，多種有效藥物和密切監測。膿毒癥發生發展過程中免疫功能紊亂是重要原因之一，但其發病的機制尚未明了。增加的調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）被廣泛認為是免疫抑制期的主要特征細胞，在膿毒癥發病機制的研究中日益得到重視。Treg是一種負向免疫調節細胞，具有免疫無反應性及免疫抑制性兩大特性。本研究旨在觀察血必凈聯合常規治療對膿毒癥患者生存質量及Treg蛋白表達的影響，探索血必凈聯合常規治療對膿毒癥的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取海南省人民醫院（以下簡稱“我院”）2013年10月～2016年10月住院的膿毒癥患者120例，納入標準：①符合Sepsis-3診斷標準[2]；②住院時間>24 h；③符合醫學倫理學要求；④患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：①心功能不全者；②肝、腎功能障礙者；③腫瘤及血液系統疾病者；④近期內服用可能影響本研究結果的藥物如抗凝劑、活血化瘀類的中藥者；④有藥物過敏史者；⑤未完成指標評估及中途退出研究者。按隨機數字表將患者分為血必凈聯合常規治療組（治療組）62例和常規治療組（對照組）58例。治療組中，男45例，女17例；年齡35～76歲，中位年齡56歲；原發病分類：重癥肺炎17例，感染性胰腺壞死10例，繼發性化膿性腹膜炎16例，化膿性膽管炎8例，細菌性腦炎8例，其他3例。對照組中，男43例，女15例；年齡29～75歲，中位年齡54歲；原發病分類：重癥肺炎19例，感染性胰腺壞死8例，繼發性化膿性腹膜炎13例，化膿性膽管炎9例，細菌性腦炎6例，其他3例。兩組患者性別、年齡和原發疾病等一般資料的差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 治療方法

兩組患者均依據《2008國際嚴重膿毒癥和膿毒性休克治療指南》[3]常規治療。治療組在常規治療的同時聯合血必凈注射液治療，由天津紅日藥業股份有限公司生產提供血必凈注射液（規格10 mL/支，批號：1505281）。將血必凈注射液100 mL加入到100 mL的生理鹽水后靜脈滴注，每天滴注3次，連續治療7 d。

1.3 觀察指標

完成常規治療及靜脈滴注血必凈7 d后評估患者治療效果。對兩組患者治療前和治療后組內和組間血清Treg水平、血清Treg蛋白表達量進行比較。

1.3.1 生存質量 參照一般狀況評分標準Karnofsky（KPS）[4]，對患者的生存質量進行評估：療程結束后，生存質量提高者為KPS評分較治療前評分增加≥10分，降低者為減少≥10分，穩定者為增加或減少<10分。

1.3.2 血清Treg水平測定 試驗中應用ELISA試劑（華美公司生產）。檢測儀器為FAME24/20型全自動酶聯檢測系統（瑞士HAMILTON公司生產）。對患者進行空腹外周靜脈血采集，通過ELISA方法檢測患者血清Treg水平：①取出酶標板，依照次序對應分別加入100μL 的標準品于空白微孔中；②加入100 μL的血清于空白微孔中，標記編號；③每孔加入50 μL的酶標記溶液；④蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫水浴箱孵育45 min；⑤洗滌；⑥顯色；⑦終止：每孔加終止液50 μL，終止反應；⑧測定：用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值），數據讀取。

1.3.3 血清Treg蛋白表達檢測 試驗中采用兔抗人Treg抗體購自美國R&G;公司，檢測儀器為上海復日公司生產的Smartscape生物顯微、電泳圖像處理系統。患者進行采集空腹外周靜脈血，通過免疫印跡（Western blot）方法檢測血清Treg mRNA的蛋白表達：①血清中總蛋白的提取；②SDS-PAGE電泳；③需轉膜；④免疫反應；⑤二抗與底物反應顯色：化學發光顯色法；⑥凝膠圖象分析：將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析標帶的分子量和凈光密度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件對所得數據進行統計分析，等級資料組間比較采用秩和檢驗，計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組生存質量比較

治療后對照組生存質量較本組治療前，12例提高，25例穩定，21例下降；治療組患者生存質量較本組治療前，45例提高，15例穩定，2例下降。兩組患者生存質量比較，差異有統計學意義（u = 6.073，P < 0.05）。

2.2 兩組血清Treg水平及其蛋白表達量比較

兩組患者治療前血清Treg水平及其蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；治療后兩組患者血清Treg水平及其蛋白表達量均較治療前顯著下降，治療組患者血清Treg水平及其蛋白表達量均低于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.3 兩預后結果比較

以入組28 d為研究終點，根據痊愈出院/轉普通病房或死亡判斷預后情況，發現治療組患者生存率為72.6%（45/62），對照組為51.7%（30/58）。對照組患者生存率顯著低于治療組，差異有統計學意義（χ2=5.52，P < 0.05）。

3 討論

據報道Treg在控制適應性和先天性免疫應答方面發揮重要作用[5-7]。盡管Treg在免疫系統中僅包含一小部分T淋巴細胞群，但這些細胞對細胞活化具有強效的調節性質，使其成為與嚴重膿毒癥相關的長期適應性免疫功能障礙的重要參與者[5，8]。在這方面，Monneret等[9]首先報道了感染性休克患者血液中循環Treg百分比增加的存在。最近，Nascimento等[10]報道，Treg細胞在實驗性敗血癥晚期觀察到的免疫功能障礙的進展和建立中起重要作用。Treg持續增加可能與膿毒癥患者的不良結局有關。其他論文指出，Treg可以在體內增殖并抑制由CD4+T細胞以及先天性免疫細胞介導的效應物應答[6]。這些細胞還可以釋放免疫調節細胞因子，例如IL-4、IL-10和TGF-β，這可能有助于在敗血癥條件下的免疫抑制[11]。血必凈注射液通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3/9的方法，有效提升膿毒癥動物的T淋巴細胞免疫反應狀態。它引導膿毒癥大鼠CD4+、CD25+、Treg凋亡，降低對T淋巴細胞增殖和分泌功能的抑制效應，提高IL-2分泌，降低叉頭翼狀螺旋轉錄因子和表面T淋巴細胞毒性相關抗原-4表達水平發揮作用[12-14]。其他數據表明，IL-10的存在與免疫抑制的發展相關，并且IL-10介導的炎性細胞因子的抑制可能在壓倒性的細菌感染和敗血癥的存在下具有有害的宿主效應。

血必凈注射液可改善機體細胞免疫抑制狀態。它加速了膿毒癥Treg凋亡，緩解了T淋巴細胞的抑制作用，引導Treg由Th2向Th1漂移起作用[15-16]。而且，血必凈注射液可提高膿毒癥小鼠的存活率，其作用機制是通過下調巨噬細胞M1，提高M2相關細胞因子水平，提升磷酸化酪氨酸蛋白激酶1和信號轉導與轉錄激活因子6表達，促使M2極化而發揮作用[17]。

對于防治膿毒癥的研究，中醫藥從整體辨證出發，進行了一系列關于膿毒癥多環節防治研究，表明中醫藥整體治療具有優勢性[18-19]。王若暉等[20]研究表明對膿毒癥，關于清除血清炎性因子、改善患者機體免疫功能方面，中西醫結合治療效果更佳。血必凈由紅花、芍藥、川芎、丹參、當歸組成，是著名急救醫學專家王今達教授依據“三證三法”原則，以“菌毒炎并治”理論為指導，在血府逐瘀湯的基礎上研制出來的一種靜脈注射液[21-23]。本研究結果顯示，血必凈聯合常規治療能提高膿毒癥患者的生存質量，抑制血清Treg蛋白表達可能是其作用機制之一，通過調節免疫功能進而發揮作用。至于它通過何種信號轉導通路、具體作用原理和它作用的靶細胞，均待進一步的研究和探討。

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（收稿日期：2018-04-02 本文編輯：金 虹）