TRPV5信號通路調控尿鈣重吸收機制的研究

陳仲萍 林俊 王群

[摘要]目的 探討TRPV5信號通路如何調控尿鈣的重吸收，影響尿鈣的濃度，從而影響到含鈣腎結石的形成。方法 將20只SD大鼠隨機抽取10只進入結石組，10只進入對照組。模型構建成功后，測定大鼠24 h尿鈣濃度，并采用免疫組化和實時熒光定量PCR，分別檢測TRPV5及其mRNA在大鼠腎臟中的表達情況。結果 結石組大鼠24 h尿鈣濃度明顯高于對照組大鼠，差異有統計學意義（P<0.01）；免疫組化顯示結石組大鼠腎臟組織的TRPV5蛋白表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）；實時熒光定量PCR顯示TRPV5mRNA表達量低于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。結論 TRPV5表達下降或缺乏可使腎小管對鈣的重吸收減少，促進含鈣腎結石的形成。

[關鍵詞]TRPV5；尿鈣；腎結石

[中圖分類號] R277.514 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）9（a）-0008-04

[Abstract] Objective To discuss how the TRPV5 signaling pathway regulates the reabsorption of urinary calcium， thus affecting the concentration of urinary calcium and thereby affecting the formation of calcium-containing kidney stones. Methods The twenty SD rats were randomly selected to take ten into the stone group， the others into the control group. After the success of the model building， the determination of 24 hours urinary calcium concentration in rats， and the expression of TRPV5 and its mRNA in rat kidney were detected by immunohistochemical and quantitative real time PCR. Results It was found that urinary calcine concentration of 24 hour in the stone group was significantly higher than that in the control group， the difference was statistically significant （P<0.01）. The expression of TRPV5 protein and its mRNA in the stone group were lower than in the control group， the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion The decrease of TRPV5 expression or lack of TRPV5 can reduce the reabsorption of calcium in renal tubules and promote the formation of calcium kidney stones.

[Key words] TRPV5； Urinary Calcium； Kidney Stone

泌尿系結石是泌尿系統的常見病、多發病，由多種因素共同作用所致，尿鈣增高容易誘發或促進含鈣尿路結石的形成。TRPV5是一種具有高度選擇性的受體活化性離子通道，并受鈣離子的反饋調節。其作為介導鈣離子跨細胞膜轉運的通道，在調控尿鈣水平中發揮關鍵作用，但其具體的調控機制仍不清楚。本研究通過研究TRPV5信號系統是否參與影響尿鈣的重吸收，從而影響尿鈣的濃度，進而影響到含鈣腎結石的形成，為進一步防治含鈣腎結石提供新的思路。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物分組 SD大鼠20只，體重約150 g，購于福建醫科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK（閩）2012-0001]。隨機抽取10只大鼠進入結石組，10只進入對照組。

1.1.2動物模型構建 1%乙二醇配制：10 ml乙二醇加純水定容至1000 ml；2%氯化氨配制：10 g氯化氨加純水定容至500 ml。結石組大鼠每只每天給予1%乙二醇自由飲水，2%氯化氨灌胃2 ml/只。對照組給予正常水，余飼養條件相同，共飼養4周。喂養4周后，將大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液后將大鼠處死，切取大鼠的一側腎臟用10%福爾馬林溶液固定，用于HE染色及免疫組化；切取大鼠的另一側腎臟保存在-80℃冰箱，用于Real-time PCR。

1.2實驗方法

1.2.1 24 h尿鈣檢查[11] 將收集到24 h大鼠尿流送生化自動分析儀檢測尿鈣濃度。

1.2.2檢測腎結石大鼠模型構建是否成功 取結石組大鼠一側腎臟做成石蠟切片后進行HE染色，在光鏡下觀察有無結石結晶形成來判斷是否造模成功。

1.2.3免疫組化 取腎臟切片進行免疫組化，檢測TRPV5在結石模型大鼠腎中的表達。

將兩組大鼠一側腎臟組織石蠟包埋后進行切片，TRPV5多克隆抗體（ABCAM公司）作為一抗（1∶20）， 山羊抗兔二抗（北京中衫金橋生物技術有限公司），PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色。用Image-Pro plus 6.0軟件做半定量分析，每個標本選取5個不重疊視野分別測定光密度，并取平均值作為該例的OD值。

1.2.4實時熒光定量PCR 取兩組大鼠另一側腎臟的腎皮質，提取出總RNA，逆轉錄成cDNA，進行Real-time PCR，檢測TRPV5在結石模型大鼠腎中的表達。

取大鼠腎臟組織約60 mg，按Trizol（美國Invitrogen公司）操作方法，抽取大鼠腎臟組織總RNA，檢測提示抽提的RNA未見明顯降解，可做為逆轉錄模板。TRPV5引物：上游引物5′-TCCGTGATGCCAACCGTACAC-3′，下游引物5′-GCCCCAATGACTGTCACGAGT-3′，GAPDH引物：上游引物5′-CGGCAAGT-TCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-CGCCAGTAGACTCCACGACAT -3′。取總RNA 2 μL，根據逆轉錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司）操作方法逆轉錄合成模板cDNA，再進行實時熒光定量PCR，檢測Ct值，計算TRPV5 Ct值與GAPDH Ct值的比值。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 24 h尿鈣檢查結果

結石組的24 h尿鈣濃度為（0.63±0.09）mmol/24 h，對照組為（0.36±0.06）mmol/24 h，結石組大鼠24 h的尿鈣濃度明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.2腎結石大鼠模型腎組織HE染色結果

結石組在腎小管區域能看到大量結石結晶形成（圖1），提示造模成功。

2.3兩組大鼠的腎臟組織免疫組化結果

結石組大鼠與對照組大鼠腎臟組織TRPV5表達的OD值分別為（0.38±0.07）、（0.62±0.10），提示TRPV5在兩組大鼠腎臟組織均有表達，且結石組大鼠腎臟組織的TRPV5蛋白表達水平低于對照組（P<0.01），并設有陰性對照（圖2-4）。

2.4 Real-time PCR結果

結石組大鼠腎臟組織的TRPV5 mRNA表達量低于對照組（P<0.01）（圖5）。

3討論

泌尿系結石由多種因素引起，我國泌尿系結石的發病率為1.2%～6.0%[1]，近年來，遺傳及代謝方面成為研究結石的熱點。鈣是泌尿系結石的重要成份，含鈣結石患者中約有1/3合并高鈣尿癥[2]。既往研究提示，尿鈣濃度升高容易誘發形成含鈣腎結石[2-3]。Daudon等[4]研究提示高鈣尿是特發性泌尿系含鈣結石形成的主要因素。泌尿系結石的治療方法有開放手術取石，體外沖擊波碎石，以及輸尿管鏡、腎鏡等聯合激光、氣壓彈道等技術，但術后復發率較高[5-6]，結石復發患者的尿鈣濃度高于結石未復發患者的尿鈣濃度[7]。Hess等[8]研究也提示，結石復發的患者中經常出現高鈣尿。因此，高鈣尿是形成泌尿系結石的重要因素。

TRPVl-TRPV6是TRPV的6個成員，其中TRPV5與TRPV6跟鈣代謝及調控有關[9-10]。TRPV5是介導鈣離子跨細胞膜轉運的通道，可以調控尿鈣水平，其表達下降可能引起高鈣尿[11]，但具體機制目前仍不清楚。鈣的主動吸收主要位于腎的遠曲小管和集合管[12]，遠曲小管的后半段（DCT2）和集合管（CNT）參與尿鈣重吸收，且是鈣離子調節激素作用部位，TRPV5在這兩個區域均有表達。TRPV5表達缺失的小鼠，其腎臟的遠曲小管和集合管對鈣離子重吸收明顯減少，用TRPV5基因敲除的小鼠研究發現其尿鈣排泄量比正常組要高出6倍[13-14]，提示TRPV5缺乏可導致高尿鈣，TRPV5對尿鈣水平的調控起到關鍵作用。TRPV5激酶構成了一種新的信號通路，Yang等[15]通過WNK（D561A/+）基因敲除鼠制作PHAⅡ動物模型，檢測遠曲小管的calbindin-D28k（CBP-D28k）表達，提示TRPV5（D561A/+）基因敲除鼠顯著表達CBP-D28k，他們認為TRPV5上調CBP-D28k的表達，是導致PHAII模型中高鈣尿的原因。對遺傳性高尿鈣結石大鼠模型研究提示其TRPV5基因和蛋白表達水平低于正常對照組大鼠，但尿鈣水平則比對照組高[16]。

由此可見，TRPV5是尿液中鈣離子重吸收的重要通道，TRPV5的表達與泌尿系結石的發生率成負相關[17]，其缺乏或表達降低可產生高鈣尿，而腎結石患者多數伴有高尿鈣，推測TRPV5表達下降導致尿鈣濃度升高，這可能是含鈣結石的形成因素之一。本實驗通過建立大鼠腎結石模型，研究結果顯示結石組大鼠的24 h尿鈣濃度明顯高于正常對照組大鼠，而其腎臟組織的TRPV5蛋白表達水平、TRPV5 mRNA表達量則低于對照組。

結合本研究結果，提示TRPV5介導鈣離子轉運通道，其表達下降或缺乏可使腎小管對鈣的重吸收減少，進而產生高鈣尿，尿液中的鈣因過飽和析出，形成含鈣腎結石。除此之外，腎臟遠曲小管后半段（DCT2）和集合管（CNT）與尿鈣重吸收密切相關，又是多種鈣離子調節激素的作用部位，TRPV5對尿鈣重吸收的調控是否受激素影響，目前相關報道較少，需進一步研究。

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（收稿日期：2018-06-20 本文編輯：閆 佩）