環境激素聯合冷應激建立勃起功能障礙大鼠模型的實驗研究*

劉鳳霞 斯依提·阿木提 阿卜杜熱伊木江·如則 薛志琴張盼盼 馬文靜 毛吾蘭·買買提依明 蔣 萍 阿地力江·伊明**

1.新疆醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室（烏魯木齊 830011）;2. 新疆醫科大學中心實驗室; 3.新疆醫科大學基礎醫學院生物學教研室

勃起功能障礙（erectile dysfuction, ED）是指陰莖持續 （至少6個月）不能達到和維持充分的勃起以獲得滿意的性生活[1]。據文獻報道，全球約有1億多ED患者，40～70歲的男性中，約有52%的男性有不同程度的ED，更因生活節奏加快、工作壓力變大及環境污染因素其發病率呈明顯上升趨勢[2]。目前針對糖尿病、高脂血癥和神經損傷等因素引發的ED基礎研究相對較多，但就環境應激、環境雌激素對勃起功能影響領域的研究相對較少，尤其是針對復合因素誘導的ED研究，相關ED動物模型則更是鮮有報道。故本研究，通過模擬環境雌激素與冷應激建立慢性復合應激大鼠模型，通過勃起功能和交配實驗成功篩選出ED大鼠模型。并通過觀測生物學體征、行為模式和性功能改變、應激相關指標變化，對此模型進行了系統評價，現報道如下。

資料與方法

一、資料

（一）實驗動物

取120只正常雄性SD大鼠（6周齡），20只性成熟雌性大鼠（2月齡），體質量（200±10）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。

（二）主要實驗儀器

RXZ-436LD型人工氣候箱（寧波江南儀器廠），酶標儀（美國BioRad公司）。

（三）主要試劑和藥物

阿樸嗎啡（apomorphine，APO，A4393-250MG，Sigma，美國）；黃體酮（120804，浙江仙琚治藥股份有限公司）；雌二醇（E2，B130613，寧波市三生藥業有限公司）；大鼠TNF-α ELISA試劑盒（貨號0707170709，RayBio，美國）、大鼠IL-1β ELISA試劑盒（貨號0707170721，RayBio，美國）；大鼠IL-17α ELISA試劑盒（貨號ab214028，abcam，美國）；大鼠糖皮質激素（GC）ELISA試劑盒（貨號BPE30607，Lengton，中國）；大鼠睪酮（T）放免試劑盒、大鼠雌二醇（E2）放免試劑盒、大鼠腎上腺素（E）放免試劑盒與大鼠去甲腎上腺素（NE）放免試劑盒均購自北京北方生物所；戊巴比妥納（貨號57-33-0，Sigma，美國 ）廠家；酒精、氯化鈉等常規試劑及耗材均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

二、方法

（一）環境雌激素樣飼料的制備

按每1 kg大鼠常規飼料中加入芫荽籽和菠菜籽各150 g，飼料由新疆醫科大學實驗動物中心提供。

（二）發情雌鼠的制備

按照文獻[3]進行發情雌鼠的制備。

（三）應激大鼠模型的建立與ED模型的篩選

取120只經勃起實驗和交配實驗證實具有正常性功能的雄性SD大鼠，隨機取20只為正常對照組（N組），余100只為建模組（M組）。大鼠行1周適應性飼養后進入實驗，N組大鼠于常規環境中飼養[溫度（20±2）℃，濕度55%～65%]，每日給300 g普通飼料。M組置于人工氣候箱中[溫度（7±2）℃，濕度85%～95%]飼養，每日給環境雌激素樣飼料300 g。動態觀測生物學體征與行為模式改變，評價應激模型成模情況，并觀測交配能力與勃起功能改變。建模24周時，M組大鼠通過APO陰莖勃起實驗和交配實驗篩選出ED大鼠模型（ED組），未成ED者為復合應激組（S組）。

（四）APO陰莖勃起實驗和交配實驗

根據文獻[3]進行APO陰莖勃起實驗和交配實驗。

（五）曠場實驗

將大鼠分別放入一規格為100cm×100cm×50cm的醫用有機板觀察箱中（XR-XZ301，上海欣軟信息科技有限公司），四壁光照強度為200 lx。攝像機記錄大鼠的運動軌跡及狀態，Noldus（Noldus，美國）軟件分析大鼠在中心區活動時間及進入中心區的次數。

（六）血清指標檢測

在新疆醫科大學第一附屬醫院核醫學放免試驗室，根據放免試試盒說明書，對大鼠血精中T、E2、E和NE水平進行檢測。根據ELISA試劑盒說明書，對大鼠血清中GC、TNF-α、IL-1β和IL-17α進行水平檢測。

三、統計學分析

結 果

一、應激大鼠體質量的變化

結果顯示，在建模第8周、16周和24周，M組大鼠體質量和體質量增長率均顯著低于N組（P＜0.05，見表1）。

二、應激大鼠行為學變化

與N組比較，M組大鼠倦臥少動，在中心區活動時間和進入中心區的次數減少，差異有統計學意義（表2，P＜0.05）。

三、應激大鼠E、NE和GC水平變化

由表3可見，與N組比較，M組大鼠血清中E水平升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；NE水平升高，GC水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

四、應激大鼠勃起功能與交配能力的變化

結果顯示，第8周、第16周和第24周，M組大鼠陰莖勃起次數、插入次數和射精次數均低于N組，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表4、表5），且隨著造模時間延長，呈減少趨勢。

表1 建模期間大鼠體質量變化（±s）

表1 建模期間大鼠體質量變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05

體質量(g) 體質量增長率(%)N組 M組 P值 N組 M組建模前 223.0±1.88 229.2±0.78 0.548 - -第8周 479.2±1.36 403.1±1.67* 0.002 114.9 75.8第16周 631.7±0.64 509.5±1.87* 0.000 31.8 26.4第24周 662.6±2.57 528.7±1.47* 0.000 4.89 3.77

表2 曠場實驗結果（±s）

表2 曠場實驗結果（±s）

與N組相比，*P＜0.05

分組 中心區活動時間(s) 進入中心區次數N組 27.63±4.65 3.40±0.26 M組 12.86±0.37* 2.12±0.03*

表3 各組大鼠E、NE和GC檢測結果（±s）

表3 各組大鼠E、NE和GC檢測結果（±s）

與N組相比，*P＜0.05

分組 E(ng/mL) NE(ng/mL) GC(ng/mL)N組 15.22±2.64 24.29±1.84 19.57±1.11 M組 17.13±1.86 38.77±1.67* 14.21±1.08*

表4 建模期間大鼠勃起次數的變化（±s）

表4 建模期間大鼠勃起次數的變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05

N組 M組 P值建模前 3.15±0.31 2.89±0.18 0.548第8周 3.00±0.33 1.71±0.12* 0.002第16周 3.70±0.25 1.47±0.13* 0.000第24周 3.50±0.38 0.37±0.03* 0.000

表5 建模期間大鼠插入次數與射精次數的變化（±s）

表5 建模期間大鼠插入次數與射精次數的變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05

射精次數N組 M組 P值 N組 M組 P值建模前 18.70±1.49 17.74±0.70 0.573 15.20±1.37 15.18±0.71 0.993第8周 16.85±1.35 12.26±0.69* 0.006 14.57±1.04 9.19±0.40* 0.000第16周 15.80±0.97 4.25±0.31* 0.000 13.15±1.01 4.43±0.32* 0.000第24周 16.65±0.91 1.00±0.17* 0.000 14.95±0.96 0.59±0.11* 0.000交配次數

五、ED大鼠血清E、NE和GC水平的變化

由表6可見，與N組相比，S組大鼠E和GC水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與N組和S組相比，ED組NE水平上升，GC水平下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表6 各組大鼠E、NE和GC水平的變化（±s）

表6 各組大鼠E、NE和GC水平的變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05；與S組相比，#P＜0.05

分組 E(ng/mL) NE(ng/mL) GC(ng/mL)N組 15.22±2.64 24.29±1.84 19.57±1.11 S組 15.94±1.95 32.98±2.00* 17.00±1.20 ED組 19.04±2.03 44.55±3.34*# 11.42±1.55*#

六、ED大鼠血清T和E2變化

由表7可見，與N組比較，S組大鼠血清中T水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05），E2水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與N組和S組相比，ED組大鼠血清中T水平降低，E2水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表7 各組大鼠血清T和E2的變化（±s）

表7 各組大鼠血清T和E2的變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05，與S組相比，#P＜0.05

分組 T(ng/mL) E2(mIU/mL)N組 3.51±0.36 4122±477.8 S組 1.33±0.12* 3905±217.3 ED組 0.93±0.13*# 5154±248.6*#

七、ED大鼠血清中IL-17α、IL-1β和TNF-α水平變化

由表8可見，與N組比較，S組和ED組大鼠血清中IL-17α、IL-1β和TNF-α表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與S組相比，ED組大鼠血清中IL-17α、IL-1β和TNF-α表達變化無統計學意義（P＞0.05）。

表8 各組大鼠血清炎癥因子水平的改變（±s）

表8 各組大鼠血清炎癥因子水平的改變（±s）

與N組相比，*P＜0.05

分組 TNF-α(ng/mL) IL-1β(ng/mL) IL-17α(ng/mL)N組 16.61±0.081 220.7±7.583 6.64±0.45 S組 17.18±0.028* 282.0±7.734* 9.442±1.28*ED組 17.26±0.041* 284.7±22.13* 9.673±1.52*

討 論

ED屬于男性常見疾病，對男性生理和心理影響極大。隨著生活方式的改變，男性工作壓力大、飲食結構改變，多喜空調制冷環境和冰箱制冷食物，導致ED發病率逐年上升。有文獻報道[4]，預計2025年，全球ED患病人數將達到3.22億。流行病學調查顯示與ED發病有關的因素包括糖尿病、心血管疾病、肥胖、泌尿系統疾病和精神疾病等[4]，該領域的基礎與臨床應用研究也得到較為深入的開展，但是，關于環境激素和冷刺激對男性ED影響的研究較少。本研究，模擬環境激素聯合冷應激的干預條件，觀察其對性行為能力和陰莖勃起功能的影響，探索了復合應激ED大鼠模型建立的可行性。

作為對應激模型的評價，一般從3個方面進行：（1）行為學上表現出焦慮樣行為，同時體質量增長緩慢；（2）下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）激活，E、NE和皮質醇水平升高；（3）慢性炎癥水平顯著升高[5]。本研究結果顯示，在環境雌激素樣飲食聯合冷應激條件的干預下，M組大鼠在建模過程中，早期呈現急躁易怒等行為學改變，腎上腺軸和交感神經興奮，但隨著時間的推移，出現倦臥少動、毛發無光等變化，體質量增長較N組顯著減緩。曠場實驗中M組大鼠在中心區活動時間和進入中心區次數顯著減少。該結果顯示，本方法建立的復合應激模型和復合應激ED大鼠模型組從行為學改變上，均符合應激模型的標準。本研究還發現M組大鼠E水平明顯升高，NE水平較N組顯著性升高，而GC水平顯著下降，提示雌激素樣飲食聯合冷應激能顯著升高大鼠應激水平。但關于GC水平顯著下降可能和長期冷暴露后對HPA軸激素水平的影響有關[6]。另一實驗結果顯示，S組和ED組大鼠外周血中TNF-α、IL-1β和IL-17α水平均顯著上升，這可能和慢性應激能損傷機體的免疫系統，導致血液中炎癥因子顯著上升，同時可見GC水平下調，而炎癥因子水平上調，該結果與國內外研究結果[7,8]得出的結論一致，亦可能與上述應激條件的長期刺激有關。

本研究中性行為學與陰莖勃起功能檢測結果顯示，在雌激素樣飲食聯合冷應激的干預下，大鼠出現應激改變的同時，性行為和陰莖勃起功能顯著減退，并隨造模時間的延長，進一步加重，至干預24周時，共有57只大鼠出現ED，成模率達56.7%。ED組大鼠血清中NE與GC水平均較N組具有顯著性差異，并和S組之間亦具有顯著性差異，提示其不僅與應激相關，同時也參與到了應激性ED的發生與發展中。本研究還發現TNF-α、IL-1β和IL-17α等炎癥因子在ED的發生發展中可能也發揮著重要的作用，其機制可能與血管事件有著密切聯系[9]。進一步研究發現，S組和ED組大鼠T表達均顯著降低，且ED組大鼠T水平顯著低于S組，而E2在ED組的表達較N組和S組顯著升高。這可能與雌激素樣飲食聯合冷應激通過影響T的分泌有關，也可能和制作雌激素樣飼料的菠菜籽、芫荽籽分別富含異黃酮、雌二醇、雌三醇等植物雌激素[10,11]，進而導致雌激素的雄激素抵抗作用有關[12,13]，并促進ED的發生。

綜上所述，運用雌激素樣飲食聯合冷應激復合干預法能夠建立慢性復合應激大鼠模型，該模型從體質量、行為學、腎上腺軸變化及炎癥反應均具備了應激模型的特征，從中篩選出的ED模型有良好的科學性，并具有ED成模率高的特點；同時，該方法較好地模擬了環境復合應激因素對性行為能力和陰莖勃起功能損傷并導致ED發生的慢性病理過程，為研究環境雌激素和冷應激在ED的發生發展中的作用機制及相關藥物的篩選與研究提供了良好的動物模型。ED的致病因素固然很多，本研究模擬臨床，通過環境雌激素與冷應激構建復合因素基礎上探討了復合應激型ED的動物模型，具有重要的科學意義，下一步將就環境激素與冷刺激在ED中的獨立致病機制作為研究的重點。