SCSA與SCD檢測精子DNA碎片指數的比較分析

徐 奎 王靈敏 楊 昊 洪 嶺 劉依萍 滕曉明*

1. 濰坊醫學院附屬生殖醫學中心（山東濰坊 261053）；2. 同濟大學附屬第一婦嬰保健院

1978年7月25日，世界上第一例試管嬰兒Louise Joy Brown在英國出生。距今為止，輔助生殖技術在全球已經開展了40多年的時間，并已廣泛應用于臨床，幫助許多不孕不育夫婦擁有了自己的孩子。雖然目前的試管嬰兒技術已經發展得相當成熟，但臨床妊娠率仍然僅約40%～50%。其中，男方的精子質量往往是不容忽視的一個重要因素。

一般來說，精液檢查項目包括精液量、精子濃度、精子活力、精子形態等。隨著對男性不育了解的深入，以往的常規檢查往往具有一定的局限性，并不能全面地反映出男方精液的質量和受精卵的發育狀況。近些年來，DNA碎片指數（DNA fragmentation index, DFI）已經被認為是評價精子質量的一項重要指標[1]。DFI反映的是精子遺傳物質的完整性，其目前的檢測方法主要有精子染色質結構測定法（sperm chromatin structure assay, SCSA）、精子染色質擴散法（sperm chromatin dispersion, SCD）、末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）、彗星測定法（comet assay）等[2,3]。本實驗主要是比較分析SCSA和SCD兩種方法檢測DFI的結果，為以后DFI檢測方法的選擇提供參考。

資料與方法

一、研究對象

研究對象為2017年5月至2018年4月在上海市第一婦嬰保健院（同濟大學附屬第一婦嬰保健院）生殖醫學中心男科實驗室就診的男性患者精液標本，所有標本的取精時間均控制在禁欲2～7d，將精液在未檢測前保存于-20℃冰箱，3d內完成檢測，共165份。

該實驗納入標準：（1）身體健康者；（2）無睪丸外傷、腮腺炎、家族遺傳性疾病及性功能障礙病史者；（3）無不良生活嗜好（酗酒、吸煙等）者。排除標準：男科檢查時發現睪丸、附睪、輸精管等有異常者。

二、方法

（一）SCSA

本方法采用浙江星博生物科技股份有限公司生產的精子核完整性染色試劑。該產品生產備案憑證備案編號：浙甬食藥監械生產備20140013號。該產品備案編號：浙甬械備20160051號。

該產品試劑盒由試劑A、B、C1、C2等4部分組成。A的成分包含Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）、NaCl、EDTA（乙二胺四乙酸）等；B的成分包含HCl、NaCl、Trition X-100（曲拉通 X-100）等；C1的成分包含檸檬酸、Na2HPO4（磷酸氫二鈉）、EDTA（乙二胺四乙酸）、NaCl等；C2的成分包含AO（吖啶橙）等。在實驗前，將C2液離心后添加到C1液中混合形成C液，混合后C液在2～8℃中避光可保存2個星期。

取出凍存的樣品，立即置于37℃水浴解凍，冰塊剛融化就要立即取出，光學顯微鏡下觀察計數。根據計數的精子濃度，取一定量的精液，用A液稀釋至100μL，終濃度為（1～2）×106個/mL的精子細胞。在稀釋后的精液中滴加200μL的B液，準確計時30s之后，迅速滴加600μL C液，避光染色5min。使用BD公司生產的流式細胞儀，平衡樣品線后將配制好的待檢測樣本加入樣品室，啟動樣品流，用低速檢測樣本，流動速度應控制在100～300個/s。待流速穩定后開始收集數據，至少應有5000個細胞的測定值加以記錄和統計。

精子核經過B液處理后，利用C液中吖啶橙染料的異染色質，使完整的精子核顯綠色熒光，而受損的精子核顯紅色熒光。若紅光比值增高，說明精子核DFI增高。

（二）SCD

本方法采用安徽安科生物工程（集團）股份有限公司生產的精子DNA碎片染色試劑盒（瑞-吉染色法）。該產品備案憑證編號：皖合械備20160005號。

該產品試劑盒是由染液A、染液B、染液C、染液D、染液E和預處理玻片等組成。

取待檢精液標本，用PBS調整濃度至（5～10）×106/mL。將染液A放置在100℃下5min，使其溶解后，再放置在37℃下5min。加入30μL精液標本于溶解后的A液中，充分混勻。取一張預處理玻片置4℃面板上，待玻片冷卻后，取20μL樣本加到玻片上并標記位置，蓋上蓋玻片，放入4℃冰箱中5min。把染液B加入9mL蒸餾水中，平皿中混勻；小心劃拉取開蓋玻片，水平置入溶液B中。室溫放置7min后，取出玻片，水平置入10mL染液C平皿中。室溫放置35min后，置入裝有蒸餾水平皿中5min，然后分別置入70%、90%、100%乙醇中2min，取出自然晾干。加10～12滴染液D染色1～3min，加10～12滴染液E用洗耳球輕輕吹勻，染色10～15min。用純凈水洗滌玻片，封片劑封片。用光學顯微鏡，于1 000倍油鏡下觀察500個精子圖片形態。

精液經處理后染色，沒有DNA碎片的精子在經過酸變性和去掉核蛋白后，DNA擴散形成特征性的暈環，而帶有DNA碎片化的精子不會產生這種特征性的暈環，根據暈環的有無和大小判斷精子的DNA碎片化程度，從而進一步計算DFI。

三、統計學處理

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、兩種方法檢測精子DFI的相關性

由圖1分別可以看出，本實驗中SCSA與SCD檢測精子DFI的相關系數r= 0.598（P＜0.01），表明兩種方法檢測DFI結果具有顯著的相關性。SCSA檢測DFI的均值為（13.64±0.81）%，SCD檢測DFI的均值為（19.17±0.93）%，SCD測得的DFI均值較SCSA高，其差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 SCD檢測精子DFI的相關性分析（單位： SCSA與%）

二、不同分組中兩種方法檢測精子DFI均值及其相關性的比較

根據《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）對精子濃度、精子活力和精子形態的參考值規定分組：

1. 按精子濃度分組：將精子濃度為（0～5）×106/mL的作為重度低濃度組，濃度為（5～10）×106/mL的作為中度低濃度組，濃度為（10～15）×106/mL的作為輕度低濃度組；濃度區間＞15×106/mL作為正常濃度組。

2. 按精子活力分組：將精子前項運動百分率（PR）＜32%作為弱精子組，PR≥32%作為正常活力組。

3. 按精子形態分組：將精子正常形態率＜4%作為畸精子組，精子正常形態率≥4%作為正常形態組。

從表1中可以看出，對于SCSA與SCD之間均值的差異，在重度低濃度組中，SCSA與SCD檢測精子DFI的均值差異沒有統計學意義（P＞0.05）；在其他各組中，均具有統計學意義（P＜0.01）。另外，從表2可以看出在重度低濃度組中，SCSA與SCD檢測精子DFI均值的相關系數r= 0.060（P＞0.05），表明兩種方法檢測DFI結果在重度低濃度組中無明顯相關性。隨著濃度逐漸升高，其相關性也隨之增大。在精子活力和形態方面，其相關性較好而且相對比較穩定。

表1 不同分組中SCSA與SCD檢測精子DFI的均值比較（%）

表2 不同分組中SCSA與SCD檢測精子DFI均值相關性的比較

討 論

男性的精子是在睪丸的生精小管中產生的，在精子發生過程之前，男性精子中的染色體是由遺傳物質DNA與4種不同類型的核小體包裹組成的。在卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH）和黃體生成素（luteotropic hormone, LH）的作用下，精子發生時，魚精蛋白替代了原先的組蛋白。在非轉錄時，魚精蛋白包裹著DNA，高度濃縮聚集在細胞核中，保護了DNA的雙螺旋結構，避免其遺傳物質的變異和丟失，維持了遺傳信息的穩定性，從而延續了物種的延續。美國Larson等研究發現[4]，目前因不明原因前來就診的男性患者中，經DFI檢測發現其DNA受損程度較高，這也為臨床診斷男性不育提供了一種診療方向。隨著生殖領域對精子DFI的逐漸重視，其目前已經成為了研究的熱點。在近幾年的報道中[5,6]，已經有關于精子DFI與精液參數和精子形態之間相關性的研究。目前，在臨床上主要采用的是SCSA和SCD這兩種方法測定DFI。

SCSA測定DFI時，正常精子的DNA與魚精蛋白緊密結合，其具有抗酸特性，不易受到外界環境的影響，從而可以維持DNA雙鏈結構的穩定性。而受損精子的DNA結構松散，在酸性環境下雙鏈DNA解鏈成單鏈DNA。在進行實驗室檢測時，吖啶橙與雙鏈DNA結合顯示綠色熒光，與單鏈DNA結合顯示紅色熒光。根據待檢測精液樣本的精子DNA受損情況不同，其所帶的熒光信號也各有差異。熒光信號可以通過流式細胞儀對大量的精子DNA碎片情況進行分析，從而得出不同精子的DFI[7]。

SCD的檢測方法是從精子細胞最初的化學變性，即由于精子細胞核和細胞膜的脫蛋白作用，DNA斷裂位點的末端開始形成單鏈DNA的過程[8]。這種檢測方法會使得DNA產生一種圍繞在細胞核周圍的暈環，在顯微鏡下可以根據暈環的大小確定精子DNA受損的程度[8]。損傷小或基本沒有損傷的精子核DNA會形成大的暈環，而那些損傷較為嚴重的精子核DNA則不產生明顯的暈環[9]。我們通過對暈環的大小進行分類和計數，可以求出DFI，進而來了解精子的受損情況。

本實驗所檢測的標本統一為-20℃保存1～3d的精液。采用冷凍精液標本檢測，主要是因為臨床客觀條件的限制。由于樣本量大，男科實驗室人力有限，只能采取冷凍精液后集中分批檢測的方式。其次，有研究表明[10,11]，最好在精液液化后4h之內進行檢查效果最佳，否則，應當對精液標本進行冷凍保存，可避免因長時間在室溫下放置而對精子的DNA造成損傷。最后，SCSA與SCD兩種方法都是檢測同等條件下的精液樣本，橫向比較條件上無差異。

本實驗研究發現，SCSA與SCD檢測精子DFI具有顯著相關性，但兩種檢測方法的均值有顯著性差異，而且SCD測得的精子DFI均值比SCSA較高。出現上述結果的原因可能是由于SCD檢測精子核周圍暈環的大小帶有人為主觀性的判斷，而且觀察者的工作經驗程度也會影響最終的結局判斷。相比較而言，SCSA是由機器測定精子DFI，具有客觀性，只要操作者在制備樣品過程中嚴格遵循實驗步驟，就可以保證結果的準確性。但由于SCSA需要購置流式細胞儀，其成本過高，普通醫療機構很難負擔得起。相反，SCD相對來說價格較低廉，可以被大多數醫療機構所接受。

通過對精子濃度、精子活力和精子形態進行分組對比，我們發現在重度低濃度組中，SCSA與SCD對精子DFI檢測結果均值的差異沒有統計學意義，而且也沒有明顯的相關性。而在其余各組中，其差異均具有統計學意義。出現上述結果的原因可能是當精子濃度極低（＜5×106/mL）時，由于精子樣本的數量少，SCD在暈環大小計數的數量上與SCSA法相近。其次，因為流式細胞儀對于檢測濃度極低的樣本有局限性。如果濃度特別低，檢測樣本時間較長，檢測的精子數量不能滿足流式細胞儀的檢測要求。而且由于長時間檢測，前一份精液樣本的殘余對之后的精液樣本產生的影響也比較大。最后，根據精子濃度分組后，重度低濃度組與其他各組相比，包含的樣本量相對較少，或許也是得出該實驗結果的一個原因。總之，該結果可給醫生在臨床上提供重要的提醒，當遇到一份重度低濃度精液檢測報告時，其本次檢測的精子DFI報告要慎重參考。另外，由于其他各組的檢測結果的差異均有統計學意義，說明精子活力大小和精子正常形態率高低對SCSA與SCD檢測精子DFI結果的差異沒有太大的影響，SCSA與SCD檢測精子DFI的結果均有明顯差異，而且其差異具有一定的相關性。

由于兩種方法具有顯著的相關性，因而各醫療機構可以根據自身的實際情況選擇合適的檢測方法。由于兩種方法的均值具有差異性，建議在實際工作的過程中，SCSA與SCD應當分別劃定各自的醫學參考值范圍供臨床醫生參考。

近年來，越來越多的研究指出，精子DFI或許比精液常規檢查能更準確地預測男方的生育能力，從而為臨床醫生的診療提供更有效的數據[12]。在實際臨床中研究發現[13]，在行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization, IVF）治療時，由于在形成受精卵過程中，卵子對可接受受精的精子具有選擇作用，從而避免了DFI很高的精子進入卵子內，確保了妊娠的質量，因此DFI的升高對妊娠結局的影響并不明顯。據2014年的一篇Meta分析[14]報道，DFI增高的患者經IVF治療時，妊娠率會有所下降。但此類患者經ICSI治療后的妊娠率并無明顯變化，而流產率則會增加。同樣，2017年林峰等[15]的一篇Meta分析也同樣印證了此類結果。上述的研究均說明了高DFI的精子在正常情況下很難與卵子結合，但由于ICSI是在人工干預下將某一精子注入卵母細胞漿內，而實驗人員在操作時無法避開DNA受損的精子。一旦選擇的精子有異常，則會影響胚胎的質量，從而導致流產的概率增加。

近幾年，DFI在男科學領域中已成為研究的熱點問題，其在生殖醫學領域中的重要性也日趨增加。受到實驗原理、儀器設備、操作者的規范程度和熟練程度等因素的影響，SCSA與SCD兩種檢測精子DFI的方法所得出的結果并不完全一致。在臨床診療中，醫生應根據兩種檢測方法的特點對于DFI的檢測結果進行綜合判斷，為患者提供更加個性化的診療方案。