基于Caspase-3研究五子衍宗丸治療少精子癥的療效及機制

柯明輝 陸 興 劉保興 王傳航

中日友好醫院男科（北京 100029）

由于生活方式和環境發生變化、生育年齡推遲等因素，男性不育的發病率不斷增高[1]。大部分不育患者無法找到明確病因，僅表現為精子質量下降，根據臨床經驗和WHO制定的指導意見[2]，精子總數可以衡量睪丸產生精子的能力，與生育結局關系最密切，因此少精子癥最容易導致男性不育。少精子癥的病因目前尚不明確，但生精細胞和精子凋亡被認為可能是導致生精障礙的一個原因[3]。中醫認為男性不育少精子癥的主要病機是腎精虧虛，補腎填精法是基本治法，五子衍宗丸被公認是該治法的代表方藥，臨床上已取得了較好的療效，很多治療不育癥的方劑都是以該方為基礎方。為了進一步明確五子衍宗丸治療男性不育少精子癥的療效和機制，筆者設計了以下研究。

資料與方法

一、總體設計

未設立對照組的研究又稱單組研究，存在不夠嚴謹、證據等級不高的缺點，但單組研究因為所有受試者都接受同一種藥物治療，具有容易操作、耗費資金少、較快獲得結果的優點，對于尚無公認有效治療藥物或共識中無金標準治療方案的疾病的研究，以及無法找到合適對照藥物的疾病的研究，可以考慮使用單組研究設計[4]。目前男性不育治療藥物中，五子衍宗丸是最被認可的藥物，常被用作臨床研究中的對照藥物，因此本研究不設對照組采用單組研究設計。

二、研究對象

研究對象為2015年3月至2016年10月來中日友好醫院男科就診的男性不育少精子癥患者50例，均符合腎精虧虛辨證標準。

（一）西醫診斷標準

參考世界衛生組織《人類精液分析實驗室技術手冊》第五版[2]制定了以下標準。

1. 男性不育診斷標準：未采取避孕措施，婚居1年或1年以上配偶未懷孕，并且排除了女方的因素，即可診斷為男性不育。

2. 少精子癥的判定標準：（1）精子總數＜39×106，且≥5×106（排除了重度少精子癥）；（2）精液量≥1.5mL（排除輸精管道梗阻、逆向射精或標本采集不全等）；（3）一周內連續檢測2次，均符合診斷標準才能入組，選擇精子總數較多的檢測結果進行記錄。

（二） 中醫腎精虧虛證辨證標準

該辨證標準是參考國家中醫藥管理局的《中醫臨床診療術語》證候部分制定[3]。

1. 主癥：精子總數減少、婚后不育；腰膝酸軟；精神萎靡。

2. 次癥：頭暈；耳鳴；健忘；乏力；失眠多夢；足跟疼痛。舌淡苔白，脈沉細弱。 具備主癥第一項和其他任意一項主癥，同時具備次癥2項即可診斷。

（三） 納入標準

1. 年齡≥20歲且≤59歲。

2. 符合男性不育診斷標準和少精子癥判定標準。3. 符合中醫腎精虧虛辨證標準。

4. 入選前3個月內未服用任何有生精作用的藥物。

5. 簽署入組知情同意書。

（四） 排除標準

1. 年齡＜20歲或＞60歲。

2. 工作環境為高溫或接觸放射線者。

3. 有不良生活習慣，如吸煙、酗酒、吸毒、經常洗桑拿和長期熬夜。

4. 有嚴重的基礎疾病，或先天性生殖系統畸形、重度精索靜脈曲張、睪丸附睪炎等。

5. 不符合中醫腎精虧虛證辨證標準。

6. 近3個月參與了其他臨床試驗研究。

7. 近6個月有高熱病史（體溫＞39℃）。

（五）失訪標準

任何原因在第3個月末預約時間點（±7d）未能到診者。

三、治療方法

治療藥物五子衍宗丸（同仁堂股份有限責任公司，國藥準字Z11020188，15106）具體成分為：枸杞子、菟絲子（炒）、覆盆子、五味子（鹽炒）、車前子。具體服藥方法為：飯后服用，6g bid。療程90d。

四、觀察內容

（一）精子質量

患者禁欲48h以上7d以內，手淫取精后將全部精液留取到專用無菌杯中，立即放入37℃的恒溫水浴箱，待精液標本完全液化后，按照世界衛生組織《人類精液分析實驗室技術手冊》第5版規定的標準操作流程及方法，用WLJY-9000型計算機輔助精子質量自動分析系統（北京偉力新世紀公司生產）進行精子質量檢查。主要記錄指標有精液量、精子總數和前向運動精子百分率（%）。

（二）Caspase-3表達

由于經費限制，隨機選擇8例病例，治療前和治療90d后各檢測一次精子凋亡率。待測的精液標本-80℃保存，采用Western blot法檢測凋亡，使用的主要試劑、抗體、儀器及檢測方法如下：

1. 主要試劑、抗體及實驗儀器：高速離心機（X I A N G Y I）、多重掃描M K 3酶標儀（hermoVE180）、垂直電泳槽（Tanon）、高電流電泳儀（BioRad）、搖床（Kylin-Bell）、BCA蛋白定量分析試劑盒（Comwin Biotech ，02912E）、聚偏二佛乙烯膜（Merc Millipore，6001）、蛋白酶抑制劑混合物（Roche，0469311）、山羊抗兔IgG-HRP（Jackson，111-035-003）、山羊抗鼠IgGHRP（Jackson，115-035-003）、Caspase-3 抗體（proteintech ，19677-1-AP）。

2. 主要實驗步驟：蛋白抽提、定量、上樣蛋白制備。配制12%分離膠、5%濃縮膠，上樣（15μg/孔），電泳（濃縮膠恒壓90V，約20min；分離膠恒壓120V），轉膜（300mA恒流；0.45μm孔徑PVDF膜，時間90min），封閉（浸于5% BSA-TBST，水平搖床中孵育1h），一抗孵育（5% BSA-TBST稀釋，4℃水平搖床孵育過夜），次日洗膜（TBST洗3次，每次10min），二抗孵育（5% BSA-TBST稀釋二抗，室溫孵育 40min），洗膜（TBST洗3次，每次10min），曝光、顯影2min、定影。

（三）一般情況

記錄年齡、BMI、睪丸平均體積等指標。睪丸體積在超聲醫生指導下進行測量，計算公式：睪丸體積=上下徑×左右徑×前后徑×0.7，測量出兩側的睪丸體積后，取平均值得出睪丸平均體積。

（四）配偶妊娠情況

臨床觀察過程中密切進行電話回訪，一旦患者回復配偶已經妊娠，立即記錄配偶年齡等信息，該病例則可以退出。

五、數據統計與描述

計量資料符合正態分布或近似符合正態分布的采用均數±標準差描述，非正態分布的用中位數±四分位數間距的方式來描述。呈正態分布或近似正態分布的計量資料，采用配對樣本的t檢驗；非正態分布分布的計量資料，采用Wilcoxon符號秩和檢驗（Wilcoxon Signed-rank test）。數據處理和統計學分析采用SPSS統計軟件，以α=0.05為檢驗水準。

結 果

一、總體完成情況

觀察期間，50例中4例因為配偶妊娠，退出臨床觀察；3例未在預約時間點（±7d）復診，視為脫落病例。4例配偶妊娠病例均有精子前向運動精子百分率較高、配偶較年輕的特點。

二、治療前后精子質量變化

治療后精液量有增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后前向運動精子百分率雖然未達到參考值標準，但顯著高于治療前，差異有統計學意義（P＜0.01）；治療后精子總數達到參考值標準，明顯比治療前增多，差異有統計學意義（P＜0.01）。具體結果見表1。

表1 治療前后精液參數變化

三、分組比較治療前后精子總數變化

根據既往文獻報道和臨床經驗，患者的一些基本狀況可能會影響男性不育的治療效果。因此，根據年齡、體質量、睪丸體積及精子前向運動精子百分率這4個因素進行分組討論。具體結果見表2。

（一）根據年齡分組

結果顯示20歲～和30歲～組治療后精子總數均明顯比治療前增多，差異有統計學意義（P＜0.05、P＜0.01）；40歲～組由于病例數過少統計學分析結果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以認為治療后精子總數有增加趨勢。

（二）根據體質量分組

正常組（1 8.5≤B M I＜2 5）和超質量組（25≤BMI＜28）治療后精子總數明顯比治療前增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；肥胖組（28≤BMI＜32）由于病例數過少統計學分析結果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以認為治療后精子總數變化不明顯，反而略有下降趨勢。

表2 分組比較治療前后精子總數

（三）根據睪丸體積分組

正常組（睪丸體積＞12mL）治療后精子總數明顯比治療前增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；異常組（睪丸體積＜12mL）由于病例數過少統計學分析結果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以認為治療后精子總數有增加趨勢。

（四）根據前向運動精子百分率分組

異常組（前向運動百分率＜32%）治療后精子總數明顯比治療前增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；正常組由于病例數過少統計學分析結果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以認為治療后精子總數有增加趨勢。

四、治療前后精子Caspase-3的表達

對治療前與治療90d后凋亡指標Caspase-3的表達進行統計分析，治療前Caspase-3為0.445±0.164，治療后為0.317±0.122，結果顯示治療后Caspase-3的表達顯著低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05），具體結果見圖1。

圖1 治療前后Caspase-3表達

討 論

70%左右的男性不育患者不能找到明確的病因，僅表現為精子總數、活力和形態方面的異常，足夠數量的前向運動精子是使配偶受孕的必要條件，因此精子數量減少最容易導致男性不育，然而很少有專門針對少精子癥的臨床研究，這是本研究的一個亮點。

精子數量減少的具體病因尚不明確，生精細胞和精子過度凋亡被認為可能引起生精障礙。國內外均有研究[6,7]顯示不育患者的生精細胞和精子凋亡率顯著高于生育力正常的人群，劉媛等[8]進一步研究發現少精子癥患者的精子凋亡率顯著增高，而弱精子癥、畸形精子癥患者的精子凋亡率與正常人群無顯著差異。干預研究也得出了類似結論，他莫昔芬增加精子數量的原理可能是抑制生精細胞凋亡[9]，五子衍宗丸等補腎填精類中藥可以通過抑制生精細胞和精子的凋亡發揮促進生精的作用[10,11]。Caspase-3被公認是細胞凋亡的主要執行者，在凋亡信號傳導的多種途徑中發揮關鍵作用[12]，因此在凋亡研究中是常用的觀察指標。已有臨床研究報道[13]Caspase-3的含量與精子濃度、精子活性均呈負相關；對錳產生生殖毒性的原理進行研究，發現上調生精細胞Caspase-3表達、誘發生精細胞凋亡可能是機制之一[14]；也有關于中藥降低Caspase-3表達的報道，王志強等[15]通過體外實驗發現，養精膠囊具有抑制精原細胞凋亡，降低其Caspase-3的表達水平的作用。因此本研究也通過Caspase-3的表達變化來觀察精子凋亡情況，結果提示下調Caspase-3表達水平可能是五子衍宗丸改善精子數量的機制之一，既往尚無類似的報道。

在療效方面，觀察過程中4例患者配偶成功受孕，提示少精子癥患者有一定的自然懷孕概率，對于經濟狀況較差而且配偶年齡偏小、精子活力較好的患者，可以建議其采取等待療法。治療后精子總數、前向運動精子百分率明顯改善，尤其是精子總數整體上已經高于參考值標準，但前向運動精子百分率未達到參考值水平，顯示五子衍宗丸對精子數量的改善優于活力。中醫理論認為“陽化氣、陰成形”，精子的數量是有形物質，依賴腎精、腎陰的滋養，而精子的運動能力需要陽氣推動，依賴腎陽的溫煦推動和幫助氣化[16,17]，本研究結果與基礎理論符合。基礎研究證實補腎法的生物學機制可能是改善性腺、附屬性腺的分泌功能[18,19]，因此理論上五子衍宗丸可以增加精液量，但本次研究并未發現治療后患者的精液量有顯著增多，可能精液量與禁欲天數、精神身體狀態、是否適應取精環境等均有關系，不是單純的反映附屬性腺的分泌功能。提示在臨床上，除了精液量過多或過少的特殊情況，一般不用過于關注精液量的變化，因為精液量的影響因素太多，應該以一次排精的精子總數為準。

將年齡、體質量、睪丸體積、精子活力作為影響療效的因素來分析，既往尚未出現采用這種方法的臨床研究報道。本次研究納入的病例介于20～51歲之間，在當前的物質條件下，男性如果無基礎疾病，其生殖能力可以保持在相對良好的水平，因此本研究未發現年齡會影響治療效果是可以解釋的。肥胖因素被公認可以影響精子質量[20,21]，而本研究也發現肥胖組治療后精子總數改變并不明顯，推測是肥胖因素導致了精子數量減少從而抵消了藥物效果，因此在藥物治療的同時，應該囑咐肥胖者加強鍛煉減輕體重以提高療效。睪丸體積一定程度上可以體現睪丸的生精功能，小睪丸者出現精子數量異常的概率也大于睪丸體積正常者，但入組病例中80%睪丸體積正常，本次觀察也并未發現小睪丸組的治療效果差于睪丸體積正常組，期待以后有大樣本的深入研究。既往對精子數量和活力的關系研究甚少，精子數量主要反映睪丸生精上皮的功能，而精子活力主要體現附睪的功能，理論上兩者應該沒有直接關系，而本研究的入組病例中80%精子活力低，顯示少精多數伴有弱精，但并未發現精子活力的差異會影響精子數量的改善程度。

本研究首次基于Caspase-3表達研究五子衍宗丸治療少精子癥的機制，在療效觀察上考慮到了多種可能的影響因素，研究指標和方法均有創新性，對臨床有指導意義。然而由于時間和經費的限制，本次研究病例數少，期望以后進行更大樣本和多中心的研究。