姜黃素預處理對干熱環境熱射病大鼠心肌氧化應激及細胞凋亡的影響

馬 娜，李佳佳，宋來陽，董 翔，康 燕，張東輝，李建瑛，許 琴，是文輝，劉江偉

(1.新疆軍區總醫院新疆特殊環境醫學重點實驗室，烏魯木齊 830000；2.解放軍69240部隊醫院，烏魯木齊 830000)

隨著全球變暖，中暑的發生率呈逐年上升趨勢。中暑(heatstroke)是一種緊急而又威脅生命的疾病,特點是體溫超過40℃，它可能導致心、肝、腎、肺、凝血系統和中樞神經系統等多個器官功能紊亂，熱射病是中暑的嚴重類型，具有高死亡率和多臟器功能障礙(MODS)特性[1-2]。中暑引起的全身炎癥反應綜合征可導致心肌細胞凋亡，在心臟損傷中起重要作用[3]。姜黃素是一種從姜黃中提取的多酚化合物，對抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗微生物有很好的療效，在保護心、肺、肝、腎及腦神經方面也有很好的作用[4-5]。已有大量實驗數據表明，氧化應激在心血管疾病的發病機制中起著重要作用，包括動脈粥樣硬化、高血壓、血管內皮功能障礙和缺血性心臟病。細胞氧化應激導致內皮細胞和血管平滑肌細胞釋放有毒的自由基，這些細胞與蛋白質、DNA或脂質等細胞成分相互作用，導致心血管病變[6]。姜黃素預處理能否有效保護熱射病引起的心肌細胞相關損傷，降低其凋亡水平，并減少氧化應激引起的相關損傷目前尚未見有關報道。本研究應用姜黃素預處理后，建立熱射病大鼠模型，通過末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測心肌凋亡細胞，并結合血清心肌酶和心肌組織氧化應激指標，探索姜黃素預處理干熱環境熱射病大鼠心肌細胞的保護作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠50只，8～10周齡，購自新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心，實驗動物許可證編號[SCXK(新)2016-0001]，體重220～260 g。動物飼養在溫度：(25 ± 2)℃，濕度：(35 ± 5)%RH，SPF級動物實驗室，自由攝取食水，使用許可證編號[SYXK(新)2016-0003]。按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

西北地區特殊環境人工實驗艙(新疆軍區總醫院研制)，全自動生化儀(Mindray BS180)，BI2000圖像分析系統(成都泰盟科技公司)。姜黃素購自日本化成株式會社，羧甲基纖維素鈉購自源葉生物，TUNEL試劑盒系Abcam公司產品，丙二醛(malondialdehyde，MDA)(生產批號：20160114)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(生產批號：20160309)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗方法

將SD大鼠放置在SPF室內適應性飼養1周，每12 h明暗交替。隨機將大鼠分為5組：①常溫對照組(normal control，NC)，生理鹽水灌胃；②干熱對照組(dry-heat control，DHC)，生理鹽水灌胃；③低劑量姜黃素預處理組(L-cur)，50 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；④中劑量姜黃素預處理組(M-cur)，100 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；⑤高劑姜黃素預處理組(H-cur)，200 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；各個實驗組連續灌胃7 d，大鼠自由飲食飲水(均經滅菌處理)。在實驗的第8天，除常溫對照組外，其余4組大鼠轉移至由新疆軍區總醫院自行研制的人工氣候艙(西北特殊環境人工實驗艙)內，環境溫度(41 ± 0.5)℃，相對濕度(10 ± 1)%，禁食禁水。復制以前建立的熱射病大鼠模型[7]，在實驗開始的150 min，將大鼠腹3%戊巴比妥腹腔麻醉后處死，取下腔靜脈血液保存并離心15 min，-80℃保存，全自動生化檢測儀檢測血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平。TUNEL法檢測心肌組織細胞凋亡(按說明書方法進行)，并在光學顯微鏡下觀察，計算凋亡率；陽性細胞即為凋亡細胞核，表現為棕色；顯色藍色細胞核的細胞為正常細胞400倍視野下拍照，每張切片隨機選取5個視野統計凋亡細胞數及總細胞數，取其平均值。計算心肌細胞凋亡指數(apoptotic index，AI)=凋亡細胞數(TUNEL陽性)/總細胞數(DAPI 陽性)×100%。染色及計數均采用雙盲法。檢測心臟組織中SOD活性及MDA水平，取心臟組織于冷生理鹽水中勻漿，按試劑盒方法進行操作，采用比色法檢測SOD活性及MDA水平。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 姜黃素對熱射病大鼠血清心肌酶的影響

大鼠血清心肌酶CK、LDH結果同時顯示，DHC組明顯高于NC組(P< 0.01)，姜黃素預處理組隨著濃度的增加，各項指標均呈下降趨勢，各濃度組與DHC組之間及各濃度組之間均差異有顯著性 (P< 0.01)。見表1。

2.2 心肌細胞凋亡率

顯微鏡下觀察：凋亡細胞核染呈棕色(圖1)，DHC組凋亡指數[(41.31 ± 2.69)%]明顯高于NC組[(5.23 ± 0.97)%]，低、中、高姜黃素預處理組凋亡指數分別為(30.00 ± 3.93)%、(15.39 ± 2.53)%、(10.55 ± 1.55)%，呈逐漸下降趨勢，與DHC組均存在顯著性差異(P< 0.01)；姜黃素組間比較差異均有顯著性(P< 0.01)。

表1 姜黃素預處理對CK、LDH的影響Table 1 Effects of curcumin pretreatment on serum CK and LDH in the rats

注：與DHC組比較，aP<0 .01；與L-cur組比較,bP< 0.01；與M-cur組比較,cP< 0.01。

Note. Compared with the DHC group,aP< 0.01; compared with the L-cur group,bP< 0.01; compared with the M-cur group,cP< 0.01.

注：A：常溫對照組；B：干燥對照組組；C:低劑量姜黃素預處理組；D: 中劑量姜黃素預處理組；E: 高劑量姜黃素預處理組。圖1 心肌細胞凋亡圖(×400)A: NC group; B: DHC group; C: L-cur group; D: M-cur group; E: H-cur group.Figure 1 Apoptosis in the rat cardiomyocytes

注：與DHC組比較，aP< 0.01；與L-cur組比較，bP< 0.01；與M-cur組比較，cP< 0.01。圖2 姜黃素對熱射病大鼠心肌細胞凋亡指數Note. Compared with the DHC group, aP < 0.01; compared with the L-cur group, bP < 0.01; compared with the M-cur group, cP < 0.01.Figure 2 Effects of curcumin on the apoptotic index of cardiomyocytes in heatstroke rats

2.3 姜黃素對熱射病大鼠心臟組織氧化應激的影響

注：與DHC組比較，aP<0.01；與L-cur組比較，bP<0.01；與M-cur組比較，cP<0.01。圖3 姜黃素對熱射病大鼠心肌組織氧化應激指標的影響Note. Compared with the DHC group, aP< 0.01; compared with the L-cur group, bP< 0.01; compared with the M-cur group, cP< 0.01.Figure 3 Effects of curcumin on the levels of oxidative stress in the myocardium of heatstroke rats

MDA在DHC組明顯高于NC組(P< 0.01)，DHC組MDA最高，隨著姜黃素預處理組濃度的增高，MDA呈逐漸下降趨勢，各個濃度組與DHC組之間及各個濃度組之間均有顯著性差異(P< 0.01)；SOD在NC組最高，DHC組最低，兩者均有顯著性差異(P< 0.01)，隨著姜黃素預處理組濃度的增加，SOD水平呈上升趨勢，其中各個濃度組之間及各濃度組與DHC組之間均存在顯著性差異(P< 0.01)。

2.4 相關性分析

姜黃素各處理組及對照組中各項指標經Pearson相關分析提示，心肌細胞凋亡與大鼠血清心肌酶CK、LDH之間存在正相關性(相關系數分別為r=0.302，r=0.304，P< 0.05)；心肌細胞凋亡與MDA之間存在正相關性(相關系數為r=0.916，P< 0.01);心肌細胞凋亡與SOD之間存在負相關性(系數為r=-0.863，P< 0.01)。

3 討論

已有研究表明，心肌細胞凋亡參與沙漠干熱環境中暑過程中的心肌損傷，姜黃素預處理可以延長沙漠干熱環境中暑大鼠的生存時間[8-9]，因此推測姜黃素可能通過抑制心肌細胞凋亡來發揮心肌損傷保護作用。本研究結果提示，不同濃度的姜黃素預處理可明顯降低心肌細胞凋亡率和心肌酶CK、LDH的數值，且心肌細胞凋亡與大鼠血清心肌酶CK、LDH之間存在正相關性，提示姜黃素預處理可能是通過減少心肌細胞凋亡在熱射病大鼠心肌損傷保護過程中發揮作用。研究發現姜黃素預處理后心肌氧化應激指標丙二醛(MDA)明顯下降，而具有抗氧化酶作用的超氧化物歧化酶(SOD)明顯上升，并在Pearson相關分析中首次發現心肌細胞凋亡與MDA呈正相關，與SOD呈負相關，表明姜黃素預處理可通過改變熱射病大鼠心肌氧化應激水平來減少心肌細胞凋亡。

SOD是主要的抗氧化酶，能有效地清除體內自由基；而MDA與線粒體膜的穩定性呈負相關，因此通過測定兩者情況可以評估機體內氧自由基水平[10-11]。在干熱應激下，活性氧(ROS)的增加，血漿和心臟組織中檢測到的抗氧化能力也隨著ROS的增加而降低，SOD水平降低。目前研究認為，ROS過量的產生會干擾心臟相關基因的表達，對心臟相關基因的表達產生不利影響，包括細胞遷移、分化、細胞增殖和細胞凋亡，這是導致心臟損傷的主要原因。Wang 等[12]研究發現，Ang II受體拮抗劑纈沙坦，有效緩解了氧化應激，阻斷Ang II信號通路，抑制了濕熱應激誘導的心肌細胞凋亡。此外，抗氧化基因的過表達逆轉了Ang II誘導的心肌細胞凋亡，熱應激會增加氧化應激，并通過Ang II信號通路引起心肌細胞凋亡。在心肌組織發生缺血缺氧損傷的過程中，氧化應激反應及細胞凋亡的過度激活是造成心肌細胞損傷的重要病理環節。氧化應激是炎癥反應中的重要環節，在心肌炎癥反應過程中可產生大量氧自由基，導致膜脂質過氧化，再經過氧化物酶分解生成MDA，最終造成肌纖維過度收縮，三磷酸腺苷耗竭，線粒體超微結構損害，使依賴能量的離子泵活性降低，進而促進鈣超載，可誘導心肌細胞凋亡[13-14]。線粒體不僅是肌細胞的動力源和能量來源，而且還能調節細胞內Ca2+的穩態，產生中間代謝物/活性氧(ROS)等細胞過程[15]。Li等[16]研究結果表明熱應激誘導產生活性氧(ROS)的細胞增加，同時線粒體凋亡通路的活性增加。

在沙漠干熱環境下機體內會出現較多的氧自由基積聚，機體抗氧化能力降低，表現為SOD的降低和MDA的升高，進而損傷心肌線粒體功能的同時引起凋亡通路的活性增加，從而加重心肌組織損害。姜黃素是從中藥姜黃中分離的重要活性成分，其具有抗炎癥反應、抗氧化應激損傷、抗凋亡以及抗腫瘤等藥理活性。本研究認為，姜黃素可能通過抗氧化應激、提高線粒體膜穩定性，在減少心肌細胞凋亡來發揮干熱環境下中暑大鼠的心肌保護作用。