細(xì)胞周期蛋白D1、CD44表達(dá)與可切除胃腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

陳恕之

(1. 揚(yáng)州大學(xué), 江蘇 揚(yáng)州, 225000;2. 江蘇省南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 儀征, 211900)

胃癌是中國常見的一種惡性腫瘤, 2017年中國國家癌癥中心報(bào)告胃癌發(fā)病率在男性中排第2位，女性中排第4位，其病死率在男女患者中均居第2位。胃癌不良預(yù)后與多種因素有關(guān)，研究[1-3]表明胃癌確診時(shí)年齡、術(shù)前血清乳酸脫氫酶(LDH)、術(shù)后腫瘤TNM分期、組織分級(jí)、Lauren分型等臨床病理因素與預(yù)后關(guān)系密切，存在于腫瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞(CSC)與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥以及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[4]。CD44分子是一類細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，是最重要的透明質(zhì)酸受體，是腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)記之一[5]。CD44可以通過激活信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)提高細(xì)胞周期數(shù)蛋白Cyclin D1的表達(dá)[6], 刺激胃癌腫瘤干細(xì)胞增殖。Cyclin D1過度表達(dá)將導(dǎo)致不可調(diào)節(jié)的失控性細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)展。目前, CD44和Cyclin D1的表達(dá)狀態(tài)與胃腺癌臨床病理學(xué)特征關(guān)系的研究尚少。本研究采用免疫組化方法檢測104例胃腺癌根治術(shù)后患者的CD44和Cyclin D1的表達(dá)狀態(tài)，并分析其與胃腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料

選取本院2014年2月—2018年2月收治的Ⅰ～Ⅲ期胃腺癌根治術(shù)后患者115例，剔除切緣陽性、資料不全及手術(shù)前新輔助化療病例11例，共納入有效病例104例，逐一調(diào)查并記錄患者一般情況(包括性別、年齡)，手術(shù)前乳酸脫氫酶(LDH)水平，手術(shù)記錄包括胃切除范圍(全胃/部分胃切除)，術(shù)后病理按照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)第7版胃癌分期整理，包括癌細(xì)胞組織學(xué)分級(jí)、浸潤深度(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(N分期)、Lauren分型。所有入選患者的手術(shù)組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，每個(gè)胃癌標(biāo)本4 μm連續(xù)貼鄰切片共5張，分別行抗Cyclin D1、抗CD44免疫組化染色。采用EnVision兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)操作。兔抗人單克隆抗體CD44、鼠抗人單克隆抗體Cyclin D1及IHC染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 結(jié)果判定方法

抗體陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為在背景清晰的情況下，特定部位呈均勻的棕黃色顆粒狀著色, CD44定位于細(xì)胞膜, Cyclin D1定位于細(xì)胞核。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Fromowitz陽性細(xì)胞半定量分級(jí)法，結(jié)合染色強(qiáng)度和范圍進(jìn)行判定。隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(10×40), 每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，先根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)計(jì)分(<5%為0分, 5%～<26%為1分, 26%～<51%為2分, 51%～75%為3分, >75%為4分)，再根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分(無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)，然后根據(jù)兩者相加所得總分進(jìn)行結(jié)果判定，所有病例的IHC染色結(jié)果按照評(píng)分設(shè)為2組，即低表達(dá)組(0～3分)和高表達(dá)組(4～7分)。見圖1。

A. Cyclin D1高表達(dá)

B. Cyclin D1低表達(dá)

C. CD44高表達(dá)

D. CD44低表達(dá)

圖1免疫組化法檢測胃癌組織CD44和CyclinD1的表達(dá)狀態(tài)(10×40)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 患者基線特征

本研究入選104例患者，按照Cyclin D1和CD44表達(dá)狀態(tài)分別分為低表達(dá)組和高表達(dá)組, Cyclin D1低表達(dá)組62例(占59.6%), 高表達(dá)組42例(占40.4%), CD44低表達(dá)組48例(占46.2%), 高表達(dá)組56例(占53.8%)。經(jīng)比較基線特征數(shù)據(jù)，不同CyclinD1和CD44表達(dá)狀態(tài)的患者構(gòu)成比或均數(shù)情況如下: 年齡(采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05)、性別、腫瘤位置差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 術(shù)前血清乳酸脫氫酶(LDH)、T分期、N分期、Lauren分型、組織學(xué)分級(jí)參數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。Cyclin D1和CD44表達(dá)狀態(tài)的關(guān)系見表2。LDH數(shù)據(jù)分布經(jīng)過Shapiro-Wilk檢驗(yàn)符合正態(tài)分布(P>0.05), 年齡分布不符合正態(tài)分布(P<0.05)。

2.2 Cyclin D1和CD44表達(dá)狀態(tài)與臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)分析

104例患者基線特征顯示: 患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤切除范圍、淋巴結(jié)清掃范圍在Cyclin D1、CD44的不同表達(dá)狀態(tài)組分布均衡; 患者術(shù)前LDH水平、術(shù)后病理T分期和N分期、Lauren分型、腫瘤組織分級(jí)在不同Cyclin D1、CD44表達(dá)狀態(tài)組分布不均衡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。橫向比較CyclinD1和CD44不同表達(dá)狀態(tài)下，上述構(gòu)成比有差異的各臨床病理學(xué)參數(shù)所占比例發(fā)現(xiàn): Cyclin D1和CD44高表達(dá)組術(shù)前乳酸脫氫酶平均水平均高于低表達(dá)組; Cyclin D1和CD44高表達(dá)組腫瘤T分期T1、T2期病例占比低于低表達(dá)組，而T3、T4期病例占比高于低表達(dá)組; Cyclin D1和CD44高表達(dá)組N分期N1、N2期病例數(shù)占比低于低表達(dá)組, N3、N4期病例占比高于低表達(dá)組; 而Cyclin D1和CD44高表達(dá)組Lauren分型腸型病例占比低于低表達(dá)組，彌漫型和混合型病例數(shù)比例高于低表達(dá)組; 同樣Cyclin D1和CD44高表達(dá)組，組織學(xué)分級(jí)為1級(jí)的病例占比低于低表達(dá)組，而組織學(xué)分級(jí)為2級(jí)、3級(jí)的病例占比高于低表達(dá)組。縱向?qū)Ρ仍谏鲜龈髋R床病理學(xué)參數(shù)類目中，不同Cyclin D1和CD44表達(dá)狀態(tài)所占比例發(fā)現(xiàn): 隨著腫瘤浸潤深度逐漸加深(T1→T4), Cyclin D1和CD44低表達(dá)組病例占比有逐漸降低的趨勢，而Cyclin D1和CD44高表達(dá)組則相反; 隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目增多(N0→N3), Cyclin D1和CD44低表達(dá)組病例占比有逐漸降低的趨勢，而高表達(dá)組則相反; 從Lauren分型類別中，預(yù)后良好的腸型在Cyclin D1和CD44低表達(dá)組病例占比高于低表達(dá)組，而預(yù)后較差的彌漫型則相反; 在組織學(xué)分級(jí)類別中，隨著腫瘤組織細(xì)胞分化程度的變差(1級(jí)→3級(jí))，Cyclin D1和CD44低表達(dá)組病例占比有逐漸降低的趨勢，而Cyclin D1和CD44高表達(dá)組則相反。上述所對(duì)比的臨床病理學(xué)參數(shù)在Cyclin D1和CD44不同表達(dá)組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Cyclin D1和CD44表達(dá)狀態(tài)相同(同時(shí)高表達(dá)或同時(shí)低表達(dá))的病例數(shù)比例遠(yuǎn)高于Cyclin D1和CD44表達(dá)狀態(tài)不同(一個(gè)高表達(dá)，另一個(gè)低表達(dá))的病例數(shù)比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果說明Cyclin D1和CD44的表達(dá)狀態(tài)與以下臨床病理學(xué)參數(shù)有關(guān): 術(shù)前LDH水平、T分期、N分期、組織學(xué)分級(jí)、Lauren分型。Cyclin D1的表達(dá)和CD44的表達(dá)之間具有聯(lián)系。

采用Spearman檢驗(yàn)法和Kendall′s tau-b檢驗(yàn)法行秩相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示: Cyclin D1、CD44的不同表達(dá)狀態(tài)分別與術(shù)前LDH水平、T分期、N分期、組織學(xué)分級(jí)、Lauren分型行相關(guān)性檢測，相關(guān)系數(shù)均介于0.2與0.4之間(P<0.05), 提示低度正相關(guān)。Cyclin D1和CD44的表達(dá)狀態(tài)之間相關(guān)性檢測相關(guān)系數(shù)r=0.736,P<0.001, 相關(guān)系數(shù)顯著性概率水平為0.01, 表明Cyclin D1和CD44的表達(dá)狀態(tài)呈現(xiàn)高度正相關(guān)。決定系數(shù)R2=0.541 7。Cyclin D1、CD44的不同表達(dá)狀態(tài)分別與性別、年齡、腫瘤位置、胃切除范圍、淋巴結(jié)清掃范圍無顯著相關(guān)性。見表3。

表1 構(gòu)成比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的臨床病理學(xué)參數(shù)列表

LDH: 乳酸脫氫酶。P值采用Pearson卡方檢驗(yàn)，百分比數(shù)據(jù)以當(dāng)前例數(shù)占總例數(shù)的比例計(jì)算。

表2 Cyclin D1和CD44表達(dá)狀態(tài)的關(guān)系[n(%)]

百分比數(shù)據(jù)以當(dāng)前例數(shù)占總例數(shù)的比例計(jì)算,Fisher精確檢驗(yàn)P<0.001。

3 討 論

Cyclin D1和CD44在胃腺癌中有較高的表達(dá)率。本研究探討可切除胃腺癌根治術(shù)后，組織標(biāo)本Cyclin D1和CD44的表達(dá)與臨床病理學(xué)特點(diǎn)的關(guān)系，結(jié)果顯示胃腺癌中Cyclin D1高表達(dá)的比例為40.4%(介于Hanaa M Ibrahim等[1]報(bào)道的50.0%和Casasola等[7]報(bào)道的29.2%之間), CD44的高表達(dá)比例為53.8%(介于Fatma Senel等[8]報(bào)道的45.0%和黃名威等[9]報(bào)道的62.4%之間)。推測造成不同研究之間Cyclin D1和CD44高表達(dá)的比例差異的原因，可能與各個(gè)實(shí)驗(yàn)試劑所采用抗體不同等因素有關(guān)。

表3 CyclinD1和CD44表達(dá)狀態(tài)與臨床病理學(xué)特征線性相關(guān)分析

LDH: 乳酸脫氫酶; LN清掃: 淋巴結(jié)清掃范圍。

*相關(guān)系數(shù)的顯著性概率水平α為0.01(雙側(cè));**為Spearman檢驗(yàn)法，其余檢驗(yàn)方法為Kendall′s tau-b檢驗(yàn)。

本研究患者的臨床病理學(xué)基線特征反映出, Cyclin D1和CD44的表達(dá)強(qiáng)度和術(shù)前LDH、T分期、N分期、Lauren分型、組織學(xué)分級(jí)等臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)，說明Cyclin D1和CD44的表達(dá)影響了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，并導(dǎo)致了上述臨床病理學(xué)參數(shù)的變化。Cyclin D1和CD44高表達(dá)導(dǎo)致了術(shù)前LDH升高、腫瘤浸潤深度較深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目較多、Lauren分型呈現(xiàn)彌漫型、組織學(xué)分級(jí)差等不良預(yù)后的臨床病理學(xué)特征。此前有研究[1、10-11]認(rèn)為Cyclin Dl的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度及TNM分期密切相關(guān)，與性別及組織類型無關(guān)，也有研究[12-13]認(rèn)為Cyclin Dl的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、TNM分期、胃癌細(xì)胞分化程度等無關(guān)。同樣有資料顯示, CD44的表達(dá)與腫瘤分化程度[14]、組織學(xué)類型[15]、TNM分期[16]、Lauren分型[17]等有關(guān)。但也有不同研究結(jié)果，如Cao等[18]研究認(rèn)為CD44表達(dá)與TNM分期無顯著相關(guān)，Arici等[19]認(rèn)為 CD44過表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管侵犯無關(guān)。本研究證實(shí)了CD44和Cyclin D1的表達(dá)狀態(tài)不僅分別與術(shù)前LDH水平、術(shù)后腫瘤T分期、N分期、組織學(xué)分級(jí)、Lauren分型等臨床病理學(xué)參數(shù)呈正相關(guān)，而且相關(guān)性檢測系數(shù)提示均為微弱相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r介于0.2～0.4), 同時(shí)也明確了CD44表達(dá)與Cyclin D1的表達(dá)呈正相關(guān)，而且相關(guān)性檢測系數(shù)為強(qiáng)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r為0.763)。

分析CD44與CyclinD1的表達(dá)狀態(tài)分別與上述臨床病理學(xué)參數(shù)呈弱相關(guān)的原因，可能與以下因素有關(guān): ⑴ Cyclin D1和CD44的表達(dá)在影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的同時(shí)，其本身的表達(dá)也受多種復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的影響。① CD44表達(dá)受到多重調(diào)控。研究[20]表明，抑癌基因p53可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制CD44的表達(dá); 而原癌基因Ras作用相反，可以促進(jìn)CD44表達(dá)[21]。其他腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)因素均可影響CD44表達(dá), TIMP1可以上調(diào)B細(xì)胞表面CD44表達(dá)水平[22]; 間質(zhì)指標(biāo)TWIST1[23]等也可正調(diào)控CD44表達(dá); 而上皮指標(biāo)E鈣黏蛋白參與對(duì)CD44的負(fù)調(diào)控[24]。此外，非編碼RNA也可調(diào)控CD44表達(dá), miR-34[25]、miR-373[26]、miR-199a[27], miR-328[28]均可以通過結(jié)合CD44 mRNA 3′-UTR抑制CD44表達(dá)。② Cyclin D1是細(xì)胞增殖周期中的啟動(dòng)因子，是G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的中樞和限速事件，其表達(dá)活性在多個(gè)水平上被精確調(diào)控，Cyclin D1活化受細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)亞基激活，細(xì)胞周期蛋白/CDK復(fù)合體磷酸化和去磷酸化等因素調(diào)控，另外, CDK蛋白抑制劑家族如P21cip1、P27kip1、P57kip2能夠抑制Cyclin D1活化; P16ink4A、P18ink4C、P19ink4D等能夠特異性抑制細(xì)胞周期蛋白D/CDK4和細(xì)胞周期蛋白D/CDK6(CDK4/6)的活化，從而抑制Cyclin D1活化。而上述調(diào)控因子的合成、降解和活化均受到細(xì)胞內(nèi)在和外在檢測點(diǎn)的調(diào)控。有研究[29]發(fā)現(xiàn), 性別決定域Y-box2(SOX2)表達(dá)可以下調(diào)Cyclin D1表達(dá)。⑵ 胃腺癌的臨床病理學(xué)參數(shù)除了與Cyclin D1和CD44表達(dá)相關(guān)外，還與其他多種因素的相關(guān)。如Her-2基因擴(kuò)增[30]、C-C趨化因子22(C-C motif chemokine 22)[31]、miR-10b、miR-21、miR-143、miR-145的表達(dá)[32]等。在上述多重因素共同復(fù)雜作用下, Cyclin D1和CD44的表達(dá)對(duì)上述臨床病理學(xué)參數(shù)的作用受到相互牽制、削弱與影響，因此表現(xiàn)為弱相關(guān)。Cyclin D1和CD44表達(dá)強(qiáng)相關(guān)，決定系數(shù)R2=0.541 7, 說明Cyclin D1和CD44能相互解釋對(duì)方54.17%的變異。推測CD44-STAT3-細(xì)胞周期蛋白D/CDK4和細(xì)胞周期蛋白D/CDK6 (CDK4/6)-Cyclin D1信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能在胃癌發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移中起到重要作用。

本研究結(jié)果顯示, Cyclin D1、CD44在胃腺癌中有比較高的表達(dá)率, Cyclin D1、CD44的表達(dá)狀態(tài)與胃腺癌不良預(yù)后因素包括術(shù)前LDH水平、術(shù)后腫瘤T分期、N分期、組織學(xué)分級(jí)、Lauren分型正相關(guān), Cyclin D1表達(dá)和CD44表達(dá)高度正相關(guān)。本研究同時(shí)將胃腺癌細(xì)胞Cyclin D1和CD44的表達(dá)與常見的胃腺癌不良預(yù)后相關(guān)臨床病理學(xué)特征的關(guān)系進(jìn)行分析，闡明兩者關(guān)系，可引導(dǎo)進(jìn)一步研究Cyclin D1和CD44在胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程所起的作用以及Cyclin D1和CD44對(duì)胃癌無進(jìn)展生存及總生存時(shí)間等預(yù)后的預(yù)測作用，并且有可能為開發(fā)胃癌治療新的靶點(diǎn)藥物提供新思路。