四君子湯血清藥效成分的HPLC-MS分析

尚如霞， 徐衛東， 許曉倩， 彭云

(1. 鎮江市食品藥品監督檢驗中心， 江蘇 鎮江 212002； 2. 江蘇大學藥學院， 江蘇 鎮江 212013)

四君子湯組方為人參、白術、茯苓、甘草，其中，人參為君藥，有抗疲勞、增強免疫力的功效；白術為臣藥，有健脾燥濕利尿功效；茯苓為佐藥，有抗腫瘤、滲濕健脾功效；甘草為使藥，甘緩和中，有抗病毒功效。四藥相輔，溫而不燥，補而不峻，共奏益氣健脾之功。其作為傳統的健脾基礎方，在肝干細胞的再生和肝細胞保護等方面起重要作用[1]，對肝纖維化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的療效。但是，其對肝干細胞的作用機制目前尚未闡述清楚，組方發揮藥效的物質基礎也不明確?；诖?，本文采用高效液相色譜-質譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)，通過分析四君子湯水煎液和含藥血清中的化學成分，探討其發揮藥效的物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠6只，體質量260～300 g，由江蘇大學實驗動物中心提供(動物合格證號：201723805)。藥品均購買自鎮江市老存仁堂藥店：白參片，產地吉林，批號170908，靖江市白山參茸有限公司；茯苓，產地安徽，批號180101，亳州吉貝爾中藥飲片有限公司；炙甘草，產地甘肅，批號171128，江蘇華洪藥業科技有限公司；白術，產地安徽，批號171201，安徽黃太中藥飲片科技有限公司。乙腈(色譜純，美國Tedia公司)。超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；超速離心機(江蘇省金壇市醫療儀器廠)；液相色譜離子阱質譜聯用儀配備電噴霧離子源(ESI，美國Thermo Fisher公司)。

1.2 四君子湯水煎液的制備

按四君子湯處方中藥物的比例，取人參、白術、茯苓各9 g，炙甘草6 g，置于500 mL燒杯內，加10倍質量的水浸泡0.5 h；將燒杯放入加熱套中，煮沸，再煎煮1 h；過濾，分離濾液和殘渣；殘渣加水6倍，煮沸后再煎煮1 h；過濾得濾液和殘渣；再將殘渣加水煮沸1 h，過濾得濾液；將3次濾液合并，置于燒杯；將燒杯置于加熱套內濃縮藥液至0.125 g/mL。放置4 ℃保存。

1.3 含藥血清的制備

將6只大鼠分為實驗組(n=4)和對照組(n=2)。實驗組用濃縮好的四君子湯水煎液，按1 mL/100 g劑量(為臨床成人劑量的10倍)灌胃，1次/d，連續7 d；對照組采用蒸餾水灌胃。在采血前禁食不禁水12 h以上，末次給藥后2 h，用5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為0.1 mL/100 g；麻醉后采用頸動脈插管于心臟取血(不抗凝)，靜置30 min，3 000 r/min室溫離心10 min；取上層血清，以0.22 μm微孔濾膜進行血清除菌，做好標記，-80 ℃儲存備用。

1.4 樣品處理

取含藥血清約4 mL，加入20 mL甲醇快速混勻震蕩，密閉超聲提取15 min；3 500 r/min室溫離心10 min；取上清液后放入坩堝里加熱濃縮，蒸干后加入1 mL甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，進樣分析。

對照組血清用于質譜分析時作為空白對照，排除空白血清的干擾。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件 Betasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A：高純水，B:乙腈；流速：0.4 mL·min-1；進樣量2 μL；柱溫：35 ℃；樣品室溫：4 ℃；梯度洗脫條件如表1所示。

1.5.2 質譜條件 ESI；噴霧電壓：3.5 kV；負離子檢測；鞘氣(N2)流速：80 arb；輔助氣(N2)流速:5 arb；毛細管溫度：300 ℃；毛細管電壓：-30 V。采用全離子掃描方式，掃描范圍(m/z)：100～1 200，碰撞氣體：氦氣；碰撞室能量：35 V；檢測波長： 210、240、280 nm。

2 結果

2.1 四君子湯化學成分分析

根據HPLC-MS聯用掃描得到的質譜圖(圖1、圖2)，查閱參考文獻[2-3]，推斷出四君子湯水煎液中含10種化學物質，其中皂苷類7種，分別為人參皂苷Rb1、Re、Rg1、Rb2、Rd、Rg3、甘草酸；黃酮類3種，分別為甘草苷、甘草素、甘草香豆素；其中人參皂苷Rb1、Re、Rg1、甘草酸為四君子湯的指標性成分。因茯苓中的萜類和有機酸，白術中的內酯類均不溶于水，故四君子湯水煎液中未能檢測到相關化合物。

推斷出四君子湯的含藥血清中含3種化學原型成分，分別為人參皂苷Rb1、Re、甘草酸；2種代謝產物分別為甘草次酸、甘草素葡萄糖醛酸。甘草次酸是由甘草酸水解脫去糖酸鏈所形成，甘草素葡萄糖醛酸亦為甘草酸水解后生成。見表2、3。

圖1 四君子湯水煎液總離子流圖

圖2 含藥血清的總離子流圖

序號保留時間(min)MrMS2成分推測168.26368367,309,297甘草香豆素298.78418417,255,135甘草苷3102.11256255,135甘草素4105.47801800,637,475人參皂苷Rg15107.85947945,783,637,474,390人參皂苷Re6120.161 1091 107,945,783,620,459人參皂苷Rb17127.211 0791 077,946,783,621,458人參皂苷Rb28136.55947946,783,621,459,375人參皂苷Rd9158.39822821,803,645,351甘草酸10160.68785783,620,458人參皂苷Rg3

表3 含藥血清化學成分分析數據

2.2 四君子湯血清原型化合物鑒定

在保留時間為87.69 min處，得到1 107.08 m/z的離子峰，查閱文獻[4]，人參中存在的人參皂苷Rb1分子式為C54H92O23，Mr為1 109.29，推測1107.08 [M-H]-m/z為其準分子離子峰；對1 107.08 m/z行MS2分析，得到945.20，782.88，620.68，459.80 m/z等碎片峰；根據元素組成分析，推測該化合物為人參皂苷Rb1。見圖3。

圖3 含藥血清中人參皂苷Rb1的二級質譜圖

在保留時間為74.43 min處，得到945.51 m/z的離子峰，查閱文獻[5]，人參中存在的人參皂苷Re分子式為C48H82O18，Mr為947.17，推測945.51 [M-H]-m/z為其準分子離子峰；對945.51 m/z行MS2分析，得到798.78，636.88，474.40 m/z等碎片峰；根據元素組成分析，推測該化合物為人參皂苷Re。見圖4。

圖4 含藥血清中人參皂苷Re的二級質譜圖

在保留時間為 126.34 min處，得到821.72 m/z的離子峰，查閱文獻[6]，甘草中存在的甘草酸分子式為C42H62O16，分子量為822.93，推測821.72 [M-H]-m/z為其準分子離子峰，對 821.72 m/z行MS2分析，得到644.85，350.62 m/z等碎片峰；根據元素組成分析，推測該化合物為甘草酸。見圖5。

圖5 含藥血清中甘草酸的二級質譜圖

2.3 四君子湯血清代謝產物的鑒定

在保留時間為102.17 min處，得到469.50 m/z的離子峰，根據文獻報道[7]，甘草代謝產物中含有甘草次酸，分子式為C30H46O4，Mr為470，推測469.50 m/z為其準分子離子峰；對469.50 m/z行MS2分析，得到 423.47 m/z等碎片峰；根據元素組成分析，推測該化合物為甘草次酸。見圖6。甘草次酸是由甘草酸水解脫去糖酸鏈所形成。

在保留時間為61.53 min處，得到255.27 m/z的離子峰，根據文獻報道[8]，甘草代謝物中存在甘草素葡萄糖醛酸，Mr為256，推測255.27 m/z為其準分子離子峰；對255.27 m/z行MS2分析，得到237.36、195.28、135.12 m/z等碎片峰；根據元素組成分析，推測該化合物物為甘草素葡萄糖醛酸。見圖7。

圖6 含藥血清中甘草次酸的二級質譜圖

圖7 含藥血清中甘草素葡萄糖醛酸的二級質譜圖

3 討論

根據HPLC-MS技術，對四君子湯水煎液及含藥血清進行檢測，得到總離子流圖以及質譜的碎片峰，推測出四君子湯水煎液中含有10種化學物質，其中皂苷類7種，分別為人參皂苷Rb1、Re、Rg1、Rb2、Rd、Rg3、甘草酸；黃酮類3種，分別為甘草苷、甘草素、甘草香豆素。人參皂苷Rb1、Re、Rg1以及甘草酸是藥典中規定人參及甘草中所必需有的化學成分，也是四君子湯中的4種指標性成分。含藥血清中有人參皂苷Rb1、Re和甘草酸3種原型化學成分，以及甘草次酸、甘草素葡萄糖醛酸兩種代謝成分(均由甘草酸水解產生)。

本實驗采用水提方法模擬傳統湯劑處方煎煮，由于茯苓中的萜類、有機酸類及白術中的內酯類均不溶于水，故無法檢測到茯苓和白術中的相關化合物；同時說明通過傳統的煎煮法，茯苓和白術的有效成分亦無法完全釋放出來。由此證實，四君子湯中的有效成分為人參及甘草，其中人參以原型化合物，而甘草則以水解產物的代謝形式存在于在血液中。