硅對鹽脅迫下甘草非藥用部位總黃酮、總皂苷積累動態的影響＊

王建寰，張文晉，郎多勇，解植彩，張新慧,2＊＊

（1.寧夏醫科大學藥學院 銀川 750004；2.寧夏回藥現代化工程技術研究中心/寧夏回醫藥協同創新中心/回醫藥現代化教育部重點實驗室 銀川 750004；3.寧夏醫科大學實驗動物中心 銀川 750004）

甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）為豆科甘草屬多年生草本植物，是世界自然基金會全球14個重點保護物種之一，也是我國2000多種中藥中用量最大的一味藥材[1]。甘草以干燥的根和根莖入藥，具有清熱解毒、潤肺止咳、調和諸藥等功效，素有“眾藥之王”、“十方九草”等美譽[2]。甘草中的有效成分主要為黃酮類、皂苷類、多糖類物質[3]。甘草的供應長期以野生資源為主，過度采挖使得其野生資源嚴重匱乏，1984年國務院頒布了禁挖甘草的禁令，甘草成為了國家重點專控藥材。隨著甘草野生資源日益枯竭及現代社會環境保護意識的加強，栽培甘草越來越成為甘草原料的重要來源。一般而言，栽培甘草生長周期為3-4年，每年可產大量甘草莖、葉資源[4]。但是，栽培甘草莖、葉多在秋季采割作牧草儲備，且對甘草藥理作用的研究主要集中在地下部位[4]。因此，合理開發利用甘草地上非藥用部位資源，契合當下生態文明建設要求及循環經濟發展需求，必將成為甘草研究的熱點之一。

同一藥用植物的不同部位，由于不同的性狀特點及主要成分積累分布質與量的差異，導致不同藥用部位藥理作用有一定差異，從而產生了中藥使用中普遍存在的“一體多用性”現象，這也是擴大藥用部位、發現新藥源、綜合利用藥物資源的重要途徑。研究表明甘草葉中總黃酮能誘導腹腔和骨髓巨噬細胞產生具有殺傷作用的細胞毒因子[5]，并且能夠抑制胃酸分泌過多[6]和膠原蛋白誘導及二磷酸腺苷誘導的血小板聚集，具有較大的開發潛力[5]。

此外，栽培甘草主要分布在我國西北的鹽漬化地區[7]。研究表明鹽脅迫對甘草生長有一定的抑制作用。當NaCl濃度達到50 mmol/L或0.3%時就會顯著抑制甘草幼苗或二年生移栽苗的生長，且這種抑制作用具有濃度效應[8,9]。目前土壤鹽漬化已成為困擾甘草栽培的重大問題之一，因此，合理開發利用鹽漬化地區的栽培甘草也成為目前研究的熱點。

硅是植物生長發育的有益元素，也是一種環境友好型元素[10]，盡管它能否被認定為植物生長發育的必需元素仍然存在較大爭議，但是近年來大量研究表明，外源硅既能促進植物生長發育，也可以降低鹽脅迫對植物的傷害，提高植物對鹽脅迫的抗性[11]。但鮮有外源硅對鹽脅迫下藥用植物非藥用部位活性成分的相關研究。

因此，本文研究了硅對鹽脅迫下甘草非藥用部位主要有效成分（總黃酮、總皂苷）積累動態的影響效應，探討鹽脅迫下不同濃度外源硅對甘草莖、葉中總黃酮、總皂苷的年積累動態規律，為更好地開發利用甘草地上部位資源，提高甘草非藥用部位有效成分、選擇適宜的甘草莖葉采收期，合理進行甘草地上部莖、葉資源的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗用甘草材料為一年生甘草幼苗，采自寧夏鹽池縣甘草種植基地，經寧夏醫科大學藥學院張新慧教授鑒定為甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）。蘆丁（批號120927，上海融禾醫藥科技有限公司）；甘草苷（批號13020901，成都曼思特生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗材料的培養

在通風、光照良好的室外開展盆栽試驗。試驗設置1個鹽脅迫水平，鹽基采用NaCl，濃度為6 g·kg-1風干土，硅源采用K2SiO3，濃度分別為風干土重的0、0.2、0.4、0.6 g SiO2/kg，共計4個處理組合。每盆裝風干土20 kg，風干土有機質含量為0.6217%，全氮0.0226%，速效磷10.5159 mg·kg-1，有效鉀107.5697 mg/kg。裝土時將NaCl和K2SiO3與土壤充分混合，試驗中因加入K2SiO3引入的K+，用KCl來維持K+濃度的一致。將同時育苗、管理一致、長勢一致的甘草苗根長修剪為20 cm，移栽于試驗盆中，每盆10株。盆栽試驗的管理措施與當地大田管理一致。

1.2.2 實驗材料的收集

7月至9月中旬，每隔30 d采集整株甘草，并分為主根、莖、葉部位，分別經烘干、粉碎、過篩后備用。對不同采樣期的甘草莖、葉分別測定其總黃酮、總皂苷含量，進行動態積累考察。

1.3 總黃酮含量的測定

1.3.1 總黃酮的提取

精密稱取甘草干燥莖、葉粉末約0.5000 g，置于25 mL容量瓶中，加入80%乙醇（含0.3%的氨水）定容，40℃超聲提取90 min，其上清液即為總黃酮提取液。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱定蘆丁純品0.0100 g，用50%的乙醇超聲30 min溶解，搖勻，冷卻，定容至50 mL，得0.2 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液，冰箱中保存，備用。精密吸取上述蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別加入5%（g·L-1）NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min后加入0.3 mL的10%的硝酸鋁溶液，放置5 min，再加l mol·L-1NaOH 2 mL，用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置6 min。在353 nm測定其吸光度，以蘆丁含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制回歸曲線（圖1），求得回歸方程為：Y=5.0586X+0.0088（R2=0.9995），表示蘆丁在0.04-0.24 mg范圍內線性關系良好。

1.3.3 樣品含量測定

吸取總黃酮提取液15 mL，分別加入5%（g·L-1）NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min后加入0.3 mL的10%的硝酸鋁溶液，放置5 min，再加l mol·L-1NaOH 2 mL，用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置6 min。在353 nm測定其吸光度，并計算相對樣品的含量（mg·kg-1）

1.3.4 方法學考察

取甘草葉粉末進行方法學考察，精密度RSD值為1.23%；重復性RSD值為0.93%；加樣回收率96.23%，RSD值為1.87%；樣品在8 h內穩定。

1.4 總皂苷含量的測定

1.4.1 總皂苷的提取

精密稱取甘草干燥莖、葉粉末約0.1000 g放置于10 mL帶刻度試管中，加10 mL甲醇，超聲40 min，離心3 min（3500 r·min-1），取其上清液，并用甲醇定容至10 mL，作為總皂苷提取液。

1.4.2 標準曲線的繪制

準確稱取人參皂苷Re對照品0.0026 g，用甲醇溶解并定容至10 mL，配置成濃度為0.26 mg·mL-1的人參皂苷Re標準溶液，作為對照品貯備液，冰箱中保存，備用。精密吸取人參皂苷Re對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL的具塞試管中，水浴蒸干溶劑，再依次加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL搖勻后，加入60%H2SO4溶液5 mL，混勻，在60℃水浴加熱20 min，立即以冰水冷卻，選用甲醇為空白對照，在523 nm測甘草樣品的總皂苷含量。以人參皂苷Re含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制回歸曲線（圖2），求得回歸方程為：Y=3.1407X+0.0047（R2=0.9942），表示人參皂苷Re在0-0.260 mg范圍內線性關系良好。

1.4.3 樣品含量測定

分別吸取制備好的根、莖、葉樣品溶液1ml，加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，搖勻后加入60%H2SO4溶液5 mL，混勻，在60℃水浴加熱20 min，立即以冰水冷卻，冷卻到室溫后，加入2 mL冰乙酸，523 nm處測定吸光度值，并計算相對樣品的含量（mg·kg-1）。

1.4.4 方法學考察

精密度RSD值為1.45%；重復性RSD值為1.78%；加樣回收率為98.45%，RSD值為2.33%；樣品在8h內穩定。

1.5 數據分析

試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗，方差分析多重比較用Duncan法（P＜0.05）；采用Excel 2003作圖。各圖中的數據均為6次重復的平均值±標準誤。

2 結果

2.1 硅對鹽脅迫下甘草莖、葉中總黃酮積累動態的影響

圖1 蘆丁標準曲線

圖2 人參皂苷Re標準曲線

甘草莖中總黃酮含量在采樣期內呈“V”字型變化，先逐漸降低，在8月達到最小值，而后略有增加；葉中總黃酮含量在采樣期內呈倒“V”字型變化，在8月底達到最大值（圖3）。從整個采樣周期內甘草不同器官總黃酮含量變化來看，葉中總黃酮含量遠高于莖。與鹽脅迫對照相比，加入不同濃度硅使7、9月份甘草莖中總黃酮含量明顯增加；而硅處理顯著增加了9月份甘草葉中總黃酮含量且以0.4 g·kg-1和0.6 g·kg-1硅濃度的作用最為明顯。

2.2 硅對鹽脅迫下甘草莖、葉中總皂苷積累動態的影響

甘草莖中總皂苷含量在整個采樣期呈倒“V”字型變化，先逐漸升高，而后在9月達到最小值；葉中總皂苷含量在整個采樣期呈遞減趨勢，在9月底達到最小值（圖4）。從整個采樣期甘草莖、葉總皂苷含量變化來看，葉中總皂苷含量明顯高于莖。與鹽脅迫對照相比，0.6 g·kg-1硅處理顯著增加了7、9月份甘草莖中總皂苷含量卻顯著降低了8月份甘草莖中總皂苷含量。而加入不同濃度硅使8、9月份甘草葉中總皂苷含量明顯增加；只有0.6 g·kg-1硅處理顯著增加了7月份甘草葉中總皂苷含量而0.2 g·kg-1、0.4 g·kg-1硅處理使甘草葉中總皂苷含量明顯降低。

圖3 硅對鹽脅迫下甘草莖、葉中總黃酮積累動態的影響

圖4 硅對鹽脅迫下甘草莖、葉中總皂苷積累動態的影響

3 討論

藥用植物的有效成分在其體內的合成與積累是其自身與一定的生長環境長期選擇的結果，外界環境在很大程度上影響著藥材的產量、質量，且對不同時期[12]、不同部位[5]的影響效應不同。而甘草的生長區以鹽漬化土壤為主，因此，鹽脅迫成為了影響甘草生長和有效成分積累[13]的一個重要的因素。研究表明，外源硅可以影響藥用植物在鹽脅迫條件下的次生代謝[14]，從而影響其活性成分的含量。由于甘草藥材中含有多種有效成分，不同濃度外源硅對鹽脅迫下不同部位、不同時期、不同有效成分的影響可能也不盡相同。

本研究發現外源硅能夠在一定程度上提高鹽脅迫下甘草莖、葉中總黃酮、總皂苷含量且這種提高效應因硅濃度、脅迫時間和不同部位而異。與鹽脅迫對照相比，加硅處理明顯提高了7、9月份甘草莖、葉中總黃酮含量（圖3），且以0.4 g·kg-1和0.6 g·kg-1硅的作用最為明顯。與鹽脅迫對照相比，0.6 g·kg-1硅處理顯著增加了7、9月份甘草莖中總皂苷含量和7、8、9月份甘草葉中總皂苷含量（圖4）。由此可見，0.6 g/kg硅對鹽脅迫下甘草7、9月份莖、葉中總黃酮、總皂苷積累的促進效應最為顯著。這可能是由于硅能進一步提高7月份甘草葉片的光合能力，促進其初生代謝和次生代謝，從而在甘草莖、葉中產生并積累了較多的黃酮類、皂苷類成分。而到8月份，隨著氣溫的降低甘草生長減緩[5]，此時期甘草本身已經在莖、葉部位積累了較多的黃酮類、皂苷類成分，使莖、葉中的總黃酮、總皂苷含量達到較大值，此時硅的效益相對較弱。而到了9月份，甘草的葉片開始脫落、地上莖逐漸干枯，地上部分的總皂苷含量降到了全年的最低點，可能與更多皂苷類物質通過莖的運輸到了地下部貯存，進而導致莖、葉中含量降低有關[15]；而甘草莖、葉中總黃酮積累趨勢卻在9月份略有上升，說明次生代謝產物之間可能有物質相互轉化的關系[15]。外源硅的加入在一定程度上提高了9月甘草莖、葉中總黃酮、總皂苷含量。

本研究表明，在整個生長期，甘草葉是總黃酮、總皂苷含量最高的器官，莖中有效成分的含量相對較少。甘草作為多年生草本植物，每年可獲得大量莖葉資源。然而，目前甘草莖、葉多作為牧草使用，其綜合利用率低下。本研究認為，以外源硅提高不同時期甘草莖、葉總黃酮、總皂苷含量為基礎，在不影響根中藥效成分積累的前提下，選擇適宜季節、根據不同需要、結合產地的地域和氣候特點采收，從而實現對甘草莖、葉藥用資源的有效開發利用。具體而言，7月是甘草的旺盛生長期，人工栽培的甘草可以通過夏季修剪（剪秧）調整植株長勢，一方面可以獲得一部分莖葉資源，另一方面可以改善通風透光條件，提高葉片光合作用也利于光合產物積累，集中營養，提高藥材的產量和質量；9月可以結合甘草藥材采收，可將地上部分莖、葉資源進行深度開發利用，進行活性成分提取，從中尋找可替代根部所含有效成分或前體化合物，對其進行加工、改造，使甘草地上資源得到更合理更深入的開發和應用。這不僅可使甘草資源得到充分利用，提高藥農種植甘草的積極性，又具有很高的經濟效益、社會效益和生態效益。