基于菌落形態、顯微特征、DNA條形碼三種策略鑒定僵蠶表面真菌＊

李紅霞，徐 清，張 帆，羅雪梅，蘆海生，劉春生，楊瑤珺

（1.北京中醫藥大學中藥學院 北京 102488；2.中國中醫科學院望京醫院 北京 100102）

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4-5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥體，具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結的功效[1]。現代研究表明僵蠶具有療效高、活性強、臨床應用廣泛等特點，并且常年出口海外[2,3]。

近年來，中藥的應用越來越廣泛，中藥質量問題受到人們的關注。有報道稱中藥飲片表面存在真菌污染的情況，這已經成為影響中藥質量的主要因素之一。王文麗[4]對45份中藥飲片進行檢測，其中的43份有真菌檢出，污染率達95%，曲霉屬真菌和青霉屬真菌為主要污染菌。秦筱茂[5]對9種常用中藥的藥用植物、個子貨藥材、飲片以及以其中7種藥材為主要原料的中成藥表面真菌污染情況進行檢測，其中27份藥用植物樣品中分離出真菌354株，真菌污染率為96%，21份個子貨和中藥飲片中分離出7屬54株真菌，真菌污染率為90%。李閩真等[6]對福建省中藥材霉菌情況進行調查，12種中藥材中檢測到霉菌10屬375540株，曲霉屬和青霉屬真菌為中藥材的主要污染菌。目前關于中藥表面真菌的研究主要集中在植物類中藥，動物類中藥表面真菌的研究較少，未查閱到關于僵蠶表面真菌的研究。

本研究對北京市零售藥店收集的僵蠶飲片表面真菌進行鑒定。采用平板法培養僵蠶表面真菌，頂端純化法對僵蠶表面真菌進行純化，獲得單一菌株。觀察真菌菌落形態、顯微結構特征，初步對真菌進行分類。提取真菌DNA，進行PCR擴增，測序結果輸入NCBI數據庫進行比對，進一步確定真菌的種類，綜合三種方法共同鑒定僵蠶表面真菌。

1 材料

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（LS-B95型 江陰濱江醫療設備廠）；OLYMPUS SXZ研究型體視顯微鏡（OLYMPUSBX51系統）；Gene Amp PCR System 9600 PCR擴增儀；Thermo Cell恒溫金屬浴（BIOER公司）；SIGMA3K-15低溫高速離心機（德國SIGMA有限公司）；GRANT制冰機；QL-88B型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器（THZ-C-1太倉市實驗設備廠蘇州培英實驗設備有限公司）

1.1.2 試劑

氨芐青霉素儲存液（100 mg·mL-1Coolaber公司）；甘油（Sigma-Aldrich公司）；乳酸酚棉藍染色液（上海源葉生物科技有限公司）；真菌基因組DNA快速提取試劑盒（Biomiga公司）；2×Bench top taq master mix；引物（Sangon Biotech公司）；無菌雙蒸水（上海源葉生物科技有限公司）

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Coolaber公司）

1.2 PCR引物

Primer 1：5-agaagtcgtaacaaggtttc-3，Primer 4：5-tcctccgcttattgatatgc-3

1.3 樣品

2017年5 月從北京市8家零售藥店收集僵蠶（蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4-5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥體）飲片。將收集的僵蠶飲片放入無菌自封袋內，密封，4℃保存備用（表1）。

2 方法

2.1 制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基

取43 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基加水1000 mL，搖勻，121℃滅菌20 min。放涼至約50℃，加入氨芐青霉素儲存液100 μL（100 mg·mL-1），制備培養基約50個，放于冰箱4℃備用。

2.2 培養僵蠶表面真菌

取僵蠶樣品適量，采用震蕩方式洗下僵蠶表面的真菌。將樣品放置在搖床上，28℃、180 r·min-1震蕩30 min，震蕩結束后靜置5 min。采用平板法對僵蠶表面真菌進行培養，取1 mL洗脫液接種于PDA培養基上，每個樣品設置2個重復。接種后的平板在28℃下，避光培養5天。

2.3 菌絲頂端純化法純化僵蠶表面真菌

5天后，取出培養基，觀察真菌的菌落形態，分別挑選形態不同的單一菌落，采用菌絲頂端純化法，接種到新的PDA培養基中，每個培養基接種3個點，28℃下，避光培養5天。獲得單一菌株，用于觀察菌體在培養基中菌落形態與生長情況。

2.4 依據菌落形態與顯微特征鑒定僵蠶表面真菌

取單一菌株，觀察平板內菌落的形態、顏色、質地、直徑等。用解剖針取一小塊真菌，放于載玻片上，滴加乳酸酚棉藍染色液染色30 s，制片。放置于光學顯微鏡下，觀察真菌菌絲形態與顏色、孢子結構特征、足細胞等。結合真菌菌落形態與顯微特征，依據《真菌鑒定手冊》初步鑒定僵蠶表面真菌。

表1 中藥飲片僵蠶樣品信息表

2.5 依據DNA條形碼鑒定僵蠶表面真菌

根據真菌基因組DNA快速提取試劑盒說明書提取DNA。提取得到的真菌DNA進行PCR擴增，反應體系為20 μL，體系包括：1 μL的DNA模板、1 μL的引物P 1、1 μL的引物P 4、10 μL的DNA聚合酶、加無菌水補充至20 μL。擴增步驟如下：94℃預變性90 s，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環反應30次，72℃5 min，4℃保持。PCR產物由上海生物工程股份有限公司測序，獲得DNA序列結果，輸入NCBI數據庫進行比對，依據NCBI數據庫比對結果進一步確定真菌種類。

3 結果

3.1 各批次僵蠶飲片表面所含真菌的數目及種類

分別對8個批次僵蠶飲片表面真菌進行培養。結果顯示，從樣品JC1中共分離得到5株真菌；樣品JC2中共分離得到96株真菌；樣品JC3中分離得到5株真菌；樣品JC4中分離得到14株真菌；樣品JC5中分離得到1株真菌；樣品JC6中分離得到2株真菌；樣品JC7中分離得到3株真菌；樣品JC8分離得到101株真菌。從僵蠶飲片表面共分離得到227株真菌。

3.2 僵蠶表面真菌菌落形態與顯微特征鑒定結果

圖1 僵蠶飲片表面真菌形態與顯微特征圖

依據真菌菌落形態，采用頂端純化法純化真菌，獲得單一菌株。根據真菌的菌落形態與顯微特征，初步將227株真菌分為10種（圖1）。結果顯示，青霉屬（Penicilliumsp.）真菌菌落圓形、邊緣整齊，多為灰綠色。顯微鏡鏡下可見菌絲、分生孢子梗具橫隔，光滑或粗糙。頂端不形成膨大的頂囊，其分生孢子梗經過多次分枝，產生幾輪對稱或不對稱的小梗，形如掃帚，稱為帚狀體（Fig.9）。曲霉屬（Aspergillussp.）真菌菌落圓形、邊緣整齊，菌落邊緣白色，中間產生孢子呈黑色。分生孢子梗由一根直立的菌絲形成，菌絲的末端形成球狀膨脹（頂囊）（Fig.6）。黑曲霉（Aspergillus niger）菌落圓形，邊緣白色，中間黑褐色。菌絲發達，多分枝，為多細胞真菌。分生孢子梗從特化的菌絲細胞（足細胞）上垂直生出，分生孢子頭狀如“菊花”（Fig.4）。依據菌落形態與顯微特征初步鑒定僵蠶表面10種真菌中的曲霉屬真菌、青霉屬真菌、黑曲霉菌。

3.3 DNA條形碼鑒定結果

僵蠶飲片表面共分離得到227株10種真菌，提取菌株DNA，采用分子鑒定方法共鑒定得到8種真菌，8種真菌分別為溜曲霉（Aspergillus tamariiFig.2）、黃曲霉（Aspergillus flavusFig.3）、黑曲霉（Aspergillus nigerFig.4）、聚多曲霉（Aspergillus sydowiiFig.5）、曲霉屬真菌（Aspergillus sp.Fig.6）、Aspergillus jensenii（Fig.8）、青霉屬真菌（Penicilliumsp.Fig.9）、焦曲霉（Aspergillus calidoustusFig.10），其中2株真菌無法進行鑒定（Fig.1、Fig.7）（表2）。Fig.3與Fig.6真菌的形態特征存在差異，顯微結構相似，DNA條形碼測序結果同為曲霉屬真菌，Fig.3真菌可以鑒定到種，但Fig.6只能鑒定到屬。基于真菌的菌落形態、顯微結構特征、DNA條形碼三種方法共同鑒定僵蠶表面真菌種類，初步了解北京市零售藥店僵蠶表面存在真菌的狀況，為研究僵蠶表面真菌提供參考依據。

3.4 小結

對僵蠶表面真菌進行培養，共得到227株10種真菌。結合3種鑒定真菌的方法，10種真菌中的8種可以鑒定，分別為溜曲霉（Aspergillus tamarii）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、曲霉屬真菌（Aspergillus sp.）、Aspergillus jensenii、青霉屬真菌（Penicillium sp.）、焦曲霉（Aspergillus calidoustus），其它2種為未知菌株。

4 討論

4.1 僵蠶飲片表面真菌鑒定結果的準確性與差異性分析

本研究結果顯示，JC2中分離得到96株真菌，JC8中分離得到101株真菌，其他6批中藥表面真菌的數目較少，可見，JC2與JC8真菌數目的統計結果與其他6個批次真菌數目存在差異較大，可能與僵蠶的來源有關，本研究中使用的僵蠶飲片收集于北京市不同的零售藥店，各藥店的貨源以及貯藏環境不同，并且，僵蠶是易霉變飲片，以上原因都可能導致僵蠶飲片表面真菌數目的不同。

本研究采用真菌菌落形態、真菌顯微結構、DNA條形碼三種方法共同鑒定僵蠶飲片表面真菌。三種鑒定方法各有優缺點，真菌菌落形態與顯微結構只能初步將真菌分類，其鑒定結果需要采用分子鑒定進行進一步的確認。但是，DNA條形碼檢測結果存在一定偏差，如在PCR擴增和測序過程中可能引入潛在的偏差；同時，測序結果需要輸入GenBank數據庫進行比對，GenBank數據庫主要充當歸檔文件，提交的許多序列存在標注不正確或定義不明確的物種名稱。據估計超過10%的公開可用真菌ITS序列在物種水平上的注釋不正確。此外，GenBank中的許多真菌ITS序列被注釋為“未鑒定真菌”。因此就需要綜合三種鑒定結果共同判斷真菌的種類，本研究中的2株未知真菌由于未得到PCR產物，因此未得到鑒定結果，需要進行進一步的研究。

表2 僵蠶表面真菌DNA檢測結果表

4.2 中藥表面真菌污染現狀及原因

中藥多來自于野生或種植養殖的動植物，經歷了生產、采收加工以及運輸貯藏等多個環節，各個環節都有可能污染真菌。陳娟等[7]對7種根類藥材中污染真菌進行分析。結果顯示，從7份根類藥材樣品中分離到6屬17種真菌，其中青霉屬真菌為主要污染菌，共有9個種，鐮刀菌屬3個種，曲霉屬2個種，其他屬3個種。宋美芳等[8]對云南省主產的3種中藥材上污染真菌進行了研究，并對不同貯藏時間中藥材真菌菌株數量進行統計，說明隨貯藏時間的延長，中藥材表面真菌數量增加。在絞股藍[9]、六神曲[10]、三七[11]和草果[11]上同樣發現了真菌污染的情況。中藥污染真菌的原因主要分為外因與內因，影響中藥表面真菌污染的外因主要包括：溫度、濕度、氧分壓、pH等。除此之外，內部因素（營養物質）也是影響真菌生長的重要條件，如碳源、氮源、礦物鹽等等。中藥中含有大量的淀粉、糖、蛋白質、脂肪等物質，能夠為真菌生長提供充足的營養物質。在適宜的溫度、濕度、氧氣等條件下，真菌可利用中藥中的營養物質進行大量的繁殖[12]。僵蠶主要的活性成分為蛋白質，可以為真菌生長提供營養，因此僵蠶表面真菌的生長可能與其所含的化學成分有關。

4.3 研究中藥表面真菌意義

本研究從僵蠶表面分離得到真菌227株，共計10種。通過觀察真菌菌落形態、顯微結構、DNA條形碼共同鑒定得到8種真菌。張鑫等[13]從久貯陳皮中分離鑒定了25株真菌，分屬于2屬5種。該研究將黑曲霉返接種到無菌陳皮樣品中，培養檢測陳皮的化學成分，發現黑曲霉代謝轉化與陳皮藥效物質變化具有相關性，黑曲霉的代謝轉化促進陳皮藥材藥效物質積累增加。從真菌黑曲霉與宿主陳皮藥效物質基礎變化的角度闡明“陳久者良”科學內涵[14]。可見中藥表面真菌與中藥藥效存在一定的關系。但是，部分真菌產生的真菌毒素可能危害人體健康。有研究表明，真菌毒素與人體的某些慢性疾病、地方性疾病關系密切，部分真菌毒素甚至有致癌的可能[15]。真菌毒素由特定真菌產生，因此控制真菌生長，對切斷真菌毒素的產生具有重要意義。可見，研究真菌對保證安全用藥具有重要意義。