美洲大蠊提取液對慢性難愈合創面細胞凋亡、蛋白聚糖及透明質酸表達的調控機制研究＊

曾娟妮，李文華，劉 筱，楊 敏，周雯婷，劉越飛，沈詠梅，何永恒＊＊

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院肛腸科 長沙 410005；2.湖南中醫藥大學 長沙 410208；3.成都高新好醫生第一醫院 成都 610202）

慢性難愈合創面是指因多種外界或內在因素引起經治療1個月以上愈合進展緩慢或仍未愈合的創面[1]。臨床中難愈合創面主要有糖尿病足潰瘍、肛瘺術后創面、壓瘡等。細胞凋亡是一種主動的、程序性的由基因控制的細胞自主性死亡方式，可清除機體衰老、畸變或惡化細胞，是多細胞生物維系其結構穩定和內環境功能平衡及生長發育必須的最基本的生物學過程[2]。肉芽組織的形成與收縮是創傷恢復過程的重要內容，在創面愈合中通過凋亡的方式使肉芽組織中的炎性細胞、成纖維細胞等各類細胞數量減少，從而促進傷口愈合。現代研究發現，細胞凋亡在慢性創面愈合過程中起著關鍵作用，美洲大蠊提取物可以誘導腫瘤細胞凋亡（Death Effector Domain，DED），那美洲大蠊是如何作用于DED的呢？透明質酸與蛋白聚糖是增殖細胞核遷移細胞胞外基質的主要成分，兩者如何影響創面的修復？該實驗應用Real Time-PCR觀察凋亡基因的表達、運用Western blot檢測細胞外基質的重要組成部分透明質酸與蛋白聚糖的光密度，從而進一步探究美洲大蠊提取液對慢性難愈合創面的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SPF級Wistar雄性大鼠60只（購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，來源證號：43004700026384），12周齡，體質量220 g-250 g，適應性喂養1周。

1.2 主要儀器設備及試劑

紫外/可見光分光光度計（Lambda35，美國Perkin Elmar公司），核酸蛋白分析儀（Bio-Photometer D30，德國eppendorf公司），實時定量PCR儀（CFX Connect，美國Bio-Rad公司），Trizol（批號15596-026，美國GIBCO公司），DNA Marker（批號SM0672，Fermentas公司），逆轉錄試劑盒（A3500，promega公司）、Real-time PCR mix（批號4367659，thermo fisher公司），引物購自上海生工公司。貝復濟15 mL/瓶（批號S10980075，珠海億勝生物有限公司）；美洲大蠊提取液100 mL/瓶（商品名：康復新【含有尿嘧啶、丙三醇等成分，不含透明質酸及蛋白聚糖】[3]，批號Z51021834，四川好醫生攀西藥業有限公司）。

1.3 分組及模型制備

將SPF級Wistar雄性大鼠隨機分為：急性全層皮膚缺損對照組（簡稱對照組），慢性創面組分為模型組、美洲大蠊提取液實驗組（簡稱實驗組）、貝復濟陽性組（簡稱陽性組）（n=15）。全層皮膚缺損+激素法制成大鼠慢性難愈合創面模型[4]。20%烏拉坦（5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠后，在其背中部脊柱兩側旁開1 cm，距肩胛骨以下2 cm用外科方法作兩條深達筋膜、直徑為18 mm的全層皮膚缺損開放性創面；造模后即刻皮下注射醋酸氫化可的松（6 mg·100 g），模型組、實驗組、陽性組大鼠按上述方法制備慢性難愈合創面模型。對照組按前述全層皮膚缺損法制成大鼠模型，但不注射氫化可的松；

1.4 換藥及取材

各組創面制備后每日用相應藥物治療，實驗組所敷紗條用康復新液（0.2 mL/cm2），陽性組所敷紗條用貝復濟（60 u/cm2），對照組與模型組創面所敷紗條用生理鹽水（0.2 mL/cm2）。各組于第3天、第8天、第15天、第20天隨機取3只大鼠取造模區深達真皮全層的創面組織被試管固定液中待用，所有大鼠在第20天取材后統一處死。

1.5 熒光實時定量PCR檢測

所取組織樣品投入RNAstore樣本-80℃保存液中凍存，進行Real-Time PCR檢測。以β-action為內參基因，模型組第3天的△CT為參照，比較各組2-△△CT差異。

1.6 Western blot檢測

圖1 bax mRNA的擴增曲線

圖2 bcl-2 mRNA的擴增曲線

圖3 caspase3 mRNA的擴增曲線

第3天、第8天、第15天、第20天，每組隨機取3個樣本組織進行Western blot檢測，用圖像分析軟件IPP6.0對圖像進行灰度分析。

1.7 統計學分析

使用SPSS23.0統計軟件，數據以x±s表示，滿足方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，若方差不齊，采用秩和檢驗。

2 結果與分析：

2.1 PCR對bcl2、bax、caspase3的檢測

2.1.1 bax、bcl-2、caspase3、β-actin的擴增曲線分析

bax、bcl-2、caspase3擴增曲線圖中，CT值在20-35之間，平臺期較穩定，拐點清晰，線性關系良好，B圖中bcl-2的Ct值最小最集中，純度最佳，對PCR反應的影響最小（圖1-3）。

2.1.2 以模型組第3天2-△△CT為參照，各組的基因表達倍數差異（表1-3）。

表1中，在第3天、第8天、第15天、第20天，模型組與對照組比較有明顯統計學意義，模型組表達最高，對照組最低（P＜0.01）。模型組與陽性組比較有顯著統計學差異，模型組高于陽性組（P＜0.01）。模型組與實驗組比較有顯著統計學差異，模型組高于實驗組（P＜0.01）。在第3-20天，對照組與模型組組內的表達有顯著統計學差異（P＜0.01），實驗組與陽性組的愈合周期變化無統計學差異（P＞0.05）。

表1 各組bax的2-△△CT比較（x±s）

表2 各組bcl-2的2-△△CT比較（x±s）

表3 各組caspase3的2-△△CT比較（x±s）

表2中，在第3天、第8天、第15天、第20天，對照組與模型組比較有顯著統計學差異，對照組表達明顯高于模型組（P＜0.01）；陽性組與模型組比較無統計學差異（P＞0.05）。在第3天，實驗組與模型組比較無統計學差異（P＞0.05），第8-20天，實驗組與模型組比較有顯著統計學差異，實驗組表達均高于陽性組（P＞0.05）。第3-20天內，對照組的愈合周期表達無統計學差異（P＞0.05），而模型組、陽性組、實驗組的愈合周期有明顯統計學差異（P＜0.01）。模型組與陽性組在第3-15天緩慢下降，至20天上升；實驗組在第3-15天逐漸上升，至20天下降。

表3中，在第3天、第8天、第15天、第20天，模型組與對照組比較有明顯統計學意義，模型組表達最高，對照組最低（P＜0.01）。模型組與陽性組比較有統計學差異，模型組高于陽性組（P＜0.05）。模型組與實驗組比較有統計學差異，模型組高于實驗組（P＜0.05）。在第3-20天，對照組與模型組的周期表達變化均無統計學差異（P＞0.05），陽性組與實驗組的愈合周期變化有明顯統計學差異，兩者第3天表達均最高，后逐漸緩慢下降（P＜0.01）。

2.3 Western blot對透明質酸與蛋白聚糖的檢測如下圖4-6

條帶干凈清晰，無拖尾、變形、跑帶等現象，符合實驗要求（圖4）。

圖5，6中，對照組與模型組的透明質酸及蛋白聚糖比較均有顯著統計學差異，對照組的兩者表達均高于模型組（P＜0.01）。陽性組與模型組的透明質酸及蛋白聚糖比較均有顯著統計學差異，陽性組的兩者表達均高于模型組（P＜0.01）。實驗組與模型組的透明質酸及蛋白聚糖比較均有顯著統計學差異，實驗組的兩者表達均高于模型組（P＜0.01）。慢性創面3組透明質酸及蛋白聚糖表達在第3天最高；模型組呈逐漸下降趨勢，陽性組第8天最低，第15天逐漸升高，第20天稍下降；實驗組第8天最低，第15天、20天逐漸升高（P＜ 0.01）。

3 討論

慢性難愈合創面是外科臨床的疑難病癥，具有病因復雜、病程長、反復發作以及可能癌病等特點[5]。現代研究指出凋亡是創面整個愈合過程中細胞數量減少的最基本、最重要的方式，也是創面愈合過程中非常重要的組成部分[6,7]。這些過程主要由抑制凋亡蛋白（Bcl-2）家族蛋白、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族蛋白調控凋亡信號的傳導，彼此相互制約組成一個完整、高效的凋亡機制網絡系統[8，9]。Bcl-2家族蛋白根據成員結構和功能的不同可以分為抗凋亡成員（BCL-2、BCL-xL）和促進凋亡成員（Bax、Bak、Bid、Bim 等)［10］。而bax與bcl-2分別是促進凋亡和抑制凋亡最典型的代表基因。caspase家族蛋白酶可直接導致細胞凋亡解體，其成員中caspase3是細胞凋亡的關鍵蛋白酶，若被激活，將導致下游的級聯反應。因此，研究bcl-2/bax與caspase3在創面修復過程中的表達及調控，對探索細胞凋亡與機體組織損傷的修復及再生具有十分重要的意義。透明質酸是一種酸性粘多糖，能調節蛋白質、水電解質擴散及運轉，蛋白聚糖可與細胞外基質中的膠原、纖粘連蛋白、層黏連蛋白及彈性蛋白結合，構成組織特性的細胞外基質，共同促進創傷愈合。

圖4 蛋白聚糖與透明質酸的條帶圖

圖5 各組創面中蛋白聚糖表達情況

圖6 各組創面中透明質酸表達情況

本實驗中實驗組與未用藥物干預的模型組比較，bax、bcl-2、caspase3表達有明顯的差異。Bax與bcl-2的比值關系決定創面的修復質量，bax占優勢細胞凋亡，bcl-2占主導時細胞存活[11]。模型組的bax在愈合周期內表達均最高，第3天、第8天、第15天的表達逐漸上升，第20天較前下降，表明前中期創面大量細胞凋亡，損傷嚴重，后期凋亡速度減慢；對照組與模型組相比，表達較低，愈合周期內bax的變化緩慢；陽性組與實驗組表達低于模型組，周期表達變化差異不明顯，處于穩定適中水平。Bcl-2中，模型組的Bcl-2的表達較其他三組低，前中期逐漸升高，后期降低；陽性組的表達明顯高于模型組，前期表達最高，中后期下降；實驗組前中期表達逐漸升高，中期達到頂峰，后期下降。Caspase3中，模型組的表達均高于其他三組，愈合周期內表達變化差異不明顯，陽性組與實驗組前期表達較高，而后處于持續下降的水平。結合三者基因的表達情況，對照組bax、caspase3的低表達，bcl-2高表達，表明創面修復進程中細胞凋亡較少，組織輕度損傷。模型組bax與caspase3高表達，bcl2低表達，組織細胞過度凋亡，可導致使創面延遲愈合[12]。而陽性組與實驗組基因表達情況，優于模型組。陽性組bax前中期上升，后期略下降，caspase3前期表達較高，而后緩慢下降，bcl-2前中期下降，后期略上升，前中期細胞凋亡祛除壞死組織與后期抗凋亡利于組織再生使創面修復。實驗組表明美洲大蠊提取液在創面愈合前期使bax、caspase3 RNA表達維持較高水平，加快創面腐肉組織脫落，中期bax、caspase3表達均緩慢下降，bcl-2上升，有利于組織的生長；bax在后期表達略升高，bcl-2、caspase3下降可減少組織的過度增生避免形成瘢痕疙瘩[13]，從而促進慢性創面的愈合。

實驗組的蛋白聚糖與透明質酸的表達明顯高于模型組。透明質酸與蛋白聚糖在第3天左右達到旺盛，可促進細胞遷移及增殖，使傷口炎癥反應減輕；第8天稍降低，而后繼續上升，促進組織的成熟和老化。表明實驗組兩者的表達情況明顯優于模型組。

綜上所述，美洲大蠊提取液能高效調控凋亡基因的趨勢化、提高透明質酸、蛋白聚糖的表達，加速難愈合創面的修復進程，為美洲大蠊提取液在臨床慢性創面的應用提供了進一步的科學依據。