響應面法優化制黃精高壓蒸制工藝研究＊

宋藝君，郭 濤，馬存德，彭秀娟，劉世軍，王志彥，孫 靜，王昌利

（1.陜西中醫藥大學藥學院 咸陽 712046；2.解放軍第451醫院 西安 710054；3.陜西步長制藥有限公司 西安 710075；4.陜西國際商貿學院 咸陽 712046）

黃精屬于百合科，其植物來源有滇黃精（PolygonatumkingianumColl.etHemsl.）、黃 精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）。黃精始載于《名醫別錄》，被列為上品。黃精為我國傳統名貴滋補中藥，具有補氣養陰、健脾潤肺、益腎的功效[1]，主要用于脾胃氣虛、胃陰不足、精血不足、腰膝酸軟等證的治療。其[2-3]所含化學成分主要有多糖、甾體皂苷、蒽醌、氨基酸等，現代藥理實驗表明，黃精具有[4-5]抗衰老、調節免疫、降血脂、降血糖、抗癌、提高和改善記憶、抗炎、抗病毒等作用。2015版《四川省中藥飲片炮制規范》收載了黑豆汁制黃精。生黃精具有刺人咽喉的副作用，經過黑豆汁制后，一方面增強健脾益腎作用，另一方面可除去麻味，同時外觀顏色也由淡黃色或黃棕色變為棕褐色至黑色。

目前黃精的炮制多采用傳統的常壓蒸制工藝[6-8]，蒸制時間長，生產效率低，資源浪費大，工藝參數不易控制，而高壓蒸制工藝[9,10]采用先進設備，節省人力、物力資源，生產效率提高，使炮制參數得到控制，從而提高炮制品質量。本研究

在文獻查閱和前期預實驗的基礎上，以總皂苷、5-HMF、多糖、醇浸出物含量和飲片外觀性狀的總評歸一值為評價指標，采用響應面實驗設計[11,12]，考察炮制壓力、悶潤時間、炮制時間和黑豆用量4個因素，首次采用高壓蒸制工藝優化黑豆汁制黃精炮制工藝，并將高壓蒸制品與常壓蒸制品進行比較，以期尋找一種更好的炮制方法。

1 實驗材料

LDZX型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；U3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；UV-2550型紫外可見分光光度計（島津公司）；BT-25S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

圖1 5-HMF對照品（A）和高壓蒸制品（B）的HPLC圖

黃精采自陜西步長制藥有限公司漢中基地，經陜西中醫藥大學藥學院胡本祥教授鑒定為百合科植物黃精Polygonatum sibiricum Red.的干燥根莖。對照品5-HMF（批號111626-201711，純度99.2%）、葡萄糖（批號110833-201707，純度 99.9%）、人參皂苷 Rb1（批號110704-201625，純度95.0%）均購于中國食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 多糖的定量測定[1]

2.1.1 對照品溶液制備

取無水葡萄糖對照品33 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無水葡萄糖0.33 mg）。

2.1.2 供試品溶液制備

取本品細粉0.25 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，加熱回流1 h，濾過，殘渣用80%熱乙醇洗滌（3次），每次10 mL，將殘渣及濾紙放燒瓶中，加水150 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次（每次10 mL），合并濾液與洗液，轉移至250 mL量瓶中，稀釋定容。量取1 mL，置試管（10 mL）中，按2.1.3項下方法，自“加水至2.0 mL”起，測定吸光度，根據標準曲線計算供試品溶液中含無水葡萄糖的重量（mg）。

2.1.3 標準曲線制備

分別精密量取對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL試管中，各加水至2.0 mL，搖勻，放置冰水浴中，緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，搖勻，放冷后于水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在582 nm處測定吸光度。以濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標作圖，得回歸方程y=32.519x+0.6383，r=0.9993。線性范圍為0.0167-0.2001 mg。

2.1.4 精密度試驗

取同一供試品溶液（響應面實驗2號樣品），按2.1.3項下方法測定y值，重復測定6次，結果RSD為0.05%，表明本方法精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液（響應面實驗2號樣品），按2.1.3項下方法，分別在0、30、60、90、120 min測定y值，結果RSD為0.50%，表明供試品溶液在2 h內基本穩定。

2.1.6 重復性試驗

取同一樣品6份，每份0.25 g，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，每份量取1 mL，按2.1.3項下方法測定y值，結果RSD為2.06%，表明本方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗

取已知黃精多糖含量的樣品6份，每份0.25 g，分別加入等量葡萄糖對照品溶液，按2.1.2項下方法制備供試品溶液并測定y值，結果平均回收率為98.79%，RSD為1.14%，表明本方法回收率良好。

2.2 5-HMF的定量測定[13]

2.2.1 色譜條件

Hypurity C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）,流動相為甲醇-水（8∶92），檢測波長280 nm，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30℃。5-HMF對照品及高壓蒸制品的HPLC圖譜見圖1。結果表明，樣品中其它成分對5-HMF的測定無干擾。

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱定5-HMF對照品適量，用甲醇溶解制成濃度為100 μg·mL-1的對照品溶液。取上述5-HMF對照品1 mL，用甲醇稀釋定容至5 mL的容量瓶，得到20 μg·mL-1的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

精密稱定樣品（1-30號）約0.2 g，置錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，稱重，加熱回流1 h，放涼至常溫，再稱重，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即可。

2.2.4 標準曲線制備

取 2.2.2項下對照品溶液，分別取 5、10、20、40、80 μL進樣，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到回歸方程Y=111.64X-0.4583，r=0.9999(n=5)，結果表明，5-HMF 在 0.1-1.6 μg范圍內與峰面積有良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗

取5-HMF對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件，連續6次進樣，結果5-HMF峰面積的RSD為0.62%，表明本儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗

按2.2.3項下方法制備供試品溶液（響應面實驗2號樣品），分別在0、4、8、12、24 h測定，結果5-HMF峰面積的RSD為0.89%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.2.7 重復性試驗

取同一樣品6份（響應面實驗2號樣品），每份0.2 g，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，然后測定峰面積，結果5-HMF峰面積的RSD為1.02%，表明本實驗方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

取已知5-HMF含量的樣品6份，每份0.2 g，分別加入一定量5-HMF對照品溶液，按2.2.3項下方法制備供試品溶液并測定峰面積，結果平均回收率為99.32%，RSD為1.41%，表明本方法回收率良好。

2.3 浸出物的定量測定

按照《中華人民共和國藥典》2015版第四部2201（浸出物測定熱浸法）項下依法測定醇溶性浸出物。

2.4 總皂苷的定量測定[14]

2.4.1 對照品溶液制備

取人參皂苷Rb15.11 mg，精密稱定，置容量瓶（10 mL）中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為0.511 mg/mL的對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液制備

取黃精粉末1 g，精密稱定，加入15 mL 80%乙醇，超聲30 min（2次），合并濾液至50 mL容量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，搖勻。

2.4.3 最大吸收波長的確定

取2.4.1，2.4.2項下所得對照品溶液240 μL、樣品溶液100 μL水浴蒸干，按2.4.4項下方法顯色，以不加樣品溶液的空白試劑作為空白對照，分別把上述對照品和樣品溶液在紫外分光光度計進行全波長掃描，結果均在550 nm處有最大吸收。故選擇檢測波長550 nm。

2.4.4 標準曲線制備

精密吸取對照品溶液120、240、360、480、600 μL，置試管中，揮干溶劑，加入0.2 mL新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混合均勻，于60℃水浴加熱15 min，冰浴5 min，取出，加入冰醋酸5 mL，以只加空白溶劑同法操作作為空白對照，在550 nm處測定吸光度。以人參皂苷Rb1質量濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程Y=70.429X+0.0217，r=0.9996，結果表明，總皂苷在61.32-306.60 μg與吸光度有良好的線性關系。

2.4.5 精密度試驗

取人參皂苷Rb1對照品溶液，按2.4.4項下方法測定A值，重復測定6次，結果RSD為0.32%，表明本方法精密度良好。

2.4.6 穩定性試驗

取同－供試品溶液（響應面實驗2號樣品），按2.4.4項下方法，分別在0、10，20、30、40 min測定A值，結果RSD為0.59%，表明供試品溶液在40 min內基本穩定。

2.4.7 重復性試驗

取同一樣品6份（響應面實驗2號樣品），每份1 g，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，每份精密吸取100 μL，按2.4.4項下方法測定A值，結果RSD為2.31%，表明本方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗

取已知總皂苷含量的樣品6份，每份1 g，分別加入一定量人參皂苷Rb1對照品溶液，按2.4.2項下方法制備供試品溶液并測定A值，結果平均回收率為97.52%，RSD為1.34%，表明本方法回收率良好。

2.5 外觀性狀評分標準

參照《四川省中藥飲片炮制規范》（2015版）黃精性狀項下規定，確定評分。評分標準見表1。

2.6 制黃精的炮制[15]

2.6.1 常壓蒸制

取凈黃精，加入適量黑豆汁，拌勻，悶潤，置蒸鍋內蒸制，取出，稍晾，切厚片，干燥。

2.6.2 高壓蒸制

取凈黃精，加入適量黑豆汁，拌勻，悶潤，置蒸汽滅菌器內高壓蒸制，取出，稍晾，切厚片，干燥。

表1 制黃精感官評分標準

2.7 單因素實驗確定各個因素水平

2.7.1 炮制壓力考察

稱取100 g黃精藥材，共5份，設定黑豆用量10%，悶潤時間1 h，炮制時間60 min，考察炮制壓力0.1、0.125、0.15、0.175、0.2 Mpa對多糖、總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評分的總評歸一值的影響，結果OD值分別為0.5734、0.6470、0.7190、0.7412、0.7629。可見隨著炮制壓力的增加，OD值持續升高，尤其在0.1-0.15 Mpa，OD值增大顯著，故選擇0.1、0.2 Mpa為炮制壓力后續實驗優化范圍。

2.7.2 悶潤時間考察

稱取100 g黃精藥材，共4份，設定炮制壓力0.15 Mpa，黑豆用量10%，炮制時間60 min，考察悶潤時間0、30、60、120 min對多糖、總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評分的總評歸一值的影響，結果OD值分別為0.6407、0.6721、0.6542、0.6496。可知延長悶潤時間后，OD值先升高，后又在小范圍內有所降低，故選擇0、120 min為悶潤時間后續實驗優化范圍。

2.7.3 蒸制時間考察

稱取100 g黃精藥材，共5份，設定炮制壓力0.15 Mpa，黑豆用量10%，悶潤時間1 h，考察蒸制時間40、50、60、70、80 min對多糖、總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評分的總評歸一值的影響，結果OD值分別為0.6430、0.7401、0.7690、0.7850、0.8121。可知延長蒸制時間后，OD值一直升高，尤其在剛開始的10 min，升高顯著，故選擇40、80 min為蒸制時間后續實驗優化范圍。

2.7.4 輔料用量考察

稱取100 g黃精藥材，共4份，設定炮制壓力0.15 Mpa，炮制時間60 min，悶潤時間1 h，考察不同黑豆用量5%、10%、15%、20%對多糖、總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評分的總評歸一值的影響，結果OD值分別為0.5430、0.6301、0.6750、0.7121。可知增加黑豆用量后，OD值一直升高，尤其在5%-10%范圍，升高顯著，故選擇5%、20%為黑豆用量后續實驗優化范圍。

2.8 響應面試驗優化制黃精高壓蒸制工藝

2.8.1 試驗設計及結果

取黃精藥材，放置于高壓蒸汽滅菌器中，在單因素試驗結果的基礎上，采用Design-Expert 7.0.0軟件，利用響應面法[11]對制黃精的高壓蒸制工藝進行優化。在試驗設計過程中，將炮制壓力(X1)、悶潤時間(X2)、炮制時間 (X3)、黑豆用量 (X4)、設定為考察因素，按2、1、0、－1、－2的最高、高、中、低、最低5水平進行編碼，以總皂苷、5-HMF、多糖、浸出物和外觀評分的OD值（Y）作為響應值。響應面試驗設計及結果見表2。

2.8.2 響應面試驗結果

采用Design-Expert 7.0.0軟件進行數據擬合，結果Y與X1、X2、X3、X4的 多 項 式 方 程 為Y＝3.12943＋7.20667X1－0.028766X3－0.2225X4－0.58875X2－0.7052X1X4＋1.903×10?3X3X4＋0.0417X2X4＋4.77768 ×10?3。

實驗結果的方差分析見表3，當P＜0.05為顯著項，P＜0.01為極顯著項。由表3可知，4個因素中，X2不顯著（P值=0.0759），其余因素為顯著項，其中X1的P值為0.0372，X3的P值為0.0119，X4的P值為0.0295，且顯著程度X3＞X4＞X1；2 次項為極顯著項（P＝0.0005），表明黑豆用量與響應值并非簡單的線性關系，交互項X1X4、X3X4、X2X4的P值分別為 0.007、0.0041、0.002，表明考察因素X1和X4、X3和X4、X2和X4之間具有特別明顯的交互作用。模型整體顯著性很好（P＜0.0001），且失擬程度不顯著（P＝0.6904），即4個因素炮制壓力(X1)、悶潤時間(X2)、炮制時間(X3)、黑豆用量(X4)、與OD值（Y）之間的變化關系能夠通過本模型較好反映，即本模型可用來對蒸制工藝進行分析和預測。

按所得模型繪制4個因素的交互作用對制黃精高壓蒸制工藝影響的3D響應面圖見圖2。由軟件得出制黃精高壓蒸制工藝為先將黃精加入8.75%黑豆，悶潤1.5 h，在0.17 Mpa壓力下蒸制50 min，取出，放涼，切厚片，干燥，OD值為0.7880。

2.9 驗證試驗及工藝比較

根據最優工藝篩選結果，結合實際情況，將最優工藝調整為壓力0.17 Mpa、悶潤時間1.5 h、炮制時間50 min、黑豆用量9%。該工藝經驗證，實驗結果見表4。根據驗證試驗結果，黃精經蒸制后，總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評分均有一定程度的增加，多糖含量減少，與常壓蒸黃精比較，高壓蒸制品中總皂苷、5-HMF、多糖、浸出物含量和外觀評分均較高，表

明本實驗優選的最佳工藝具有一定的穩定性。

表2 高壓蒸黃精響應面試驗設計及結果

表3 方差分析

圖2 4個因素交互作用的三維響應面圖

表4 黃精生品及各炮制品的定量測定結果（n=3）

3 討論

高壓蒸制是借助高溫和高壓的非常強的熱穿透作用，使藥材容易被蒸透，從而達到炮制的目的。本方法操作簡單，方便控制溫度、壓力和時間，且省工省時,節約能源，提高了工作效率，便于生產，已成為現代研究的熱點。本研究發現，高壓蒸制與常壓蒸制黃精相比，可最大程度保持總皂苷、多糖等有效成分的含量，可很大程度縮短炮制時間[16]，提示高壓蒸制法可能成為制黃精炮制的一種有效、快捷的新方法。

在總皂苷的測定中，有學者采用薯蕷皂苷元作為對照[17]，也有學者以人參皂苷Rb1[18]作為對照，本研究以人參皂苷Rb1為對照采用分光光度法測定總皂苷含量。在總皂苷供試品溶液的制備中，比較了回流法、超聲法和微波提取法，發現總皂苷含量加熱回流法＞超聲波法＞微波法，考慮到加熱回流法溫度高可能造成皂苷的破壞，而超聲法簡便、高效、且溫度低，可有效保護皂苷不被破壞，故選擇超聲法提取總皂苷。考慮到黃精總皂苷中既有極性較大的皂苷，也有極性較小的皂苷和皂苷元，所以提取溶劑極性需要慎重選擇，據預試結果，80%乙醇作為提取溶劑合適。

黃精因為含有大量的多糖，在加熱炮制時可能發生氨基酸類成分與還原糖類成分的美拉德反應，從而產生5-羥甲基糠醛等反應產物。目前，5-HMF的藥理作用仍存在爭議。有研究認為5-HMF能夠有效防治神經退行性疾病、認知損害和抗心肌缺血[19]，可改變血液流變學，抗氧化，增進血紅細胞變性[20]，也有研究發現其具有刺激性（皮膚、黏膜、眼睛），可通過和人體蛋白結合而引起中毒，從而造成內臟損害和橫紋肌麻痹，且具有潛在的生殖及遺傳毒性[21]。

5-HMF的抗氧化作用、防治神經退行性疾病和認知損害作用支持了黃精的抗氧化、避免缺氧的神經細胞凋亡、改善學習記憶能力的藥理作用，以上說明5-HMF對黃精的藥理作用具有一定的貢獻度，因此測定5-HMF在炮制過程中含量的變化情況對黃精的炮制工藝研究具有重要的價值。