喉癌癌組織Survivin基因表達水平與凋亡相關因子水平的關系*

牟基偉，張美佳，吳 建

(佳木斯大學附屬第一醫院耳鼻喉科,黑龍江佳木斯 154003)

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤，指發生在喉部的惡性腫瘤，以鱗狀細胞癌最為常見，其發生機制目前尚不明確，可能與吸煙、飲酒、大氣污染、病毒感染、放射損傷、接觸有毒化學物質等相關[1-3]。隨著癌基因研究的深入，越來越多的研究發現喉癌發生與凋亡相關基因失活等存在緊密聯系，Survivin是近年來新發現的凋亡抑制蛋白家族成分，可以抑制細胞凋亡，調節細胞周期，參與惡性腫瘤發生、發展[4-5]。目前針對喉癌癌組織Survivin基因表達與凋亡相關因子水平研究較少，因此本文選取佳木斯大學附屬第一醫院2013年1月至2018年1月126例喉癌患者手術切除的癌組織石蠟標本為研究對象，探討Survivin基因表達水平與bcl-2、p53、caspase-3等凋亡相關因子的關系,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 材料取自佳木斯大學附屬第一醫院2013年1月至2018年1月126例喉癌患者手術切除的癌組織石蠟標本，均經病理組織學證實為鱗狀細胞癌，所有患者術前均未接受放化療。其中男77例，女51例，年齡37～69歲，平均(53.54±9.64)歲；腫瘤部位：聲門上型53例，聲門型43例，聲門下型30例；TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期38例，Ⅲ期54例，Ⅳ期20例；分化程度：高分化64例，中分化38例，低分化24例；淋巴結轉移：頸淋巴結轉移陽性30例，頸淋巴結轉移陰性96例。另選取100例聲帶息肉標本，病理證實為炎癥或正常黏膜組織。本研究獲得黑龍江省佳木斯大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

1.2實驗方法 切片常規脫蠟，蒸餾水洗滌2～3次，經微波抗原熱修復后，采用免疫組織化學法檢測Survivin、bcl-2、p53、caspase-3蛋白表達，用已知陰性組織作為陰性對照，用已知胃癌陽性片作為陽性對照，試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。在高倍鏡下選取5個視野，計數500個細胞，記錄染色細胞百分比，Survivin主要在細胞質中著色，bcl-2主要在細胞質或細胞膜中著色，p53主要在細胞核中著色，caspase-3主要在細胞質中著色，采用Sinicrope改良法判斷Survivin、bcl-2、p53、caspase-3蛋白陽性，染色細胞小于5%為陰性，染色細胞大于或等于5%為陽性。染色結果由2名病理科專家進行雙盲判定，意見不統一時商討后達成一致。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測Survivin、bcl-2、p53、caspase-3表達量，試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

2 結 果

2.1Survivin基因表達與喉癌患者臨床病理特征的關系 126例喉癌癌組織標本中共檢出Survivin陽性86例，陽性率為68.3%(86/126)。Survivin陽性組年齡、性別、腫瘤部位與Survivin陰性組比較差異無統計學意義(P>0.05)，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、淋巴結轉移患者比例顯著高于Survivin陰性組(P<0.05)，見表1。

表1 Survivin基因表達與喉癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]

續表1 Survivin基因表達與喉癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.2喉癌癌組織與聲帶息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3陽性率比較 喉癌癌組織Survivin、bcl-2、p53陽性率顯著高于聲帶息肉(P<0.05)，caspase-3陽性率顯著低于聲帶息肉(P<0.05)，見圖1、表2。

A：Survivin陽性，染色部位在細胞漿；B:bcl-2陽性，染色部位在細胞漿和細胞膜；C:p53陽性，染色部位在細胞核；D:caspase-3陽性，染色部位在細胞漿

表2 喉癌癌組織與聲帶息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3陽性率比較[n(%)]

2.3喉癌癌組織Survivin基因表達與bcl-2、p53、caspase-3的關系 經Spearson相關性分析，喉癌癌組織Survivin表達與bcl-2、p53表達呈正相關，與caspase-3表達呈負相關，見表3。

2.4喉癌癌組織與聲帶息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3表達量比較 喉癌癌組織Survivin、bcl-2、p53表達量顯著高于聲帶息肉(P<0.05)，caspase-3表達量顯著低于聲帶息肉(P<0.05)，見表4。

2.5喉癌癌組織Survivin表達量與bcl-2、p53、caspase-3的關系 經Spearson相關性分析，喉癌癌組織Survivin表達量與bcl-2、p53呈正相關(r=0.385、0.407，P<0.05)，與caspase-3呈負相關(r=-0.471，P<0.05)。

表3 喉癌癌組織Survivin基因表達與bcl-2、p53、caspase-3的關系(n)

表4 喉癌癌組織與聲帶息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3表達量比較

3 討 論

腫瘤是一類細胞周期疾病，經歷多基因、多步驟突變，細胞呈失控性生長，其中細胞凋亡失衡是腫瘤發生、發展的重要機制[6-7]。凋亡抑制蛋白家族是一類抑制凋亡的調節因子，Survivin是上世紀九十年代末發現的凋亡抑制蛋白家族新成員，定位于人類染色體17q25，由142個氨基酸組成，只表達于腫瘤與胚胎組織，與其他凋亡抑制蛋白家族成員比較，Survivin結構簡單，具有其他成員無可比擬的抗凋亡能力。近年來研究顯示，在肺癌、喉癌、胃癌、結直腸癌、鼻咽癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤均可發現Survivin過表達，Survivin已成為腫瘤診斷與治療的新靶點[8-10]。

本研究采用免疫組織化學法檢測喉癌癌組織中Survivin基因，Survivin陽性率為68.3%，與以往研究結果相似[11-12]。喉癌癌組織Survivin陽性患者TNM分期、分化程度、淋巴結轉移與Survivin陰性患者比較差異有統計學意義(P<0.05)，隨著腫瘤進展，Survivin表達增強，抑制異常突變細胞凋亡，使細胞分裂得以繼續，加快喉癌發展，增加癌轉移風險。細胞凋亡過程受細胞凋亡促進因子與凋亡抑制因子共同影響。Survivin可作為喉癌臨床病理指標，對喉癌發生、發展及轉移具有一定診斷與預測價值。本研究顯示，喉癌組織Survivin、bcl-2、p53陽性率顯著高于聲帶息肉，caspase-3陽性率顯著低于聲帶息肉，提示Survivin及bcl-2、p53、caspase-3等凋亡相關因子與喉癌發生、發展存在一定聯系。bcl-2是一種細胞凋亡的拮抗基因，在人體內以二聚體形式發揮作用，可以延長細胞生命周期，使受損細胞對凋亡刺激因素產生耐受性，從而延長細胞壽命[13-14]。本研究顯示，喉癌癌組織Survivin表達與bcl-2表達呈正相關，可能由于Survivin基因所在染色體不穩定，導致bcl-2基因轉錄激活，二者協同發揮抗凋亡效應。p53是一種腫瘤抑制基因，定位與人類染色體p13，由391個氨基酸組成，可以使細胞分裂終止于復制前期與合成期，誘導細胞凋亡，修復DNA損傷[15-16]。自然型p53半衰期短，免疫組織化學難以檢出，本研究所檢測到的p53為突變型p53。p53發生基因突變時，自然型p53功能喪失活性，促使細胞向惡性轉化，并積聚于細胞內，延長半衰期，使免疫組織化學法可以有效檢測。本研究顯示，喉癌癌組織Survivin表達與p53表達呈正相關，可能與喉癌發生后自然型p53失活相關。caspase-3是細胞凋亡過程中一種重要效應因子，以酶原形式存在，對細胞死亡刺激發生應答而被激活，使多種與細胞周期相關蛋白失活，促使細胞失活[17]。相關研究顯示，腫瘤組織內的caspase-3表達量顯著低于正常組織[18]。本研究顯示，喉癌癌組織Survivin表達與caspase-3表達呈負相關，主要由于Survivin對caspase-3活化形式具有抑制作用，阻止其自然激活，并與caspase-3特異性結合，造成其活性喪失，抑制細胞凋亡。

綜上所述，Survivin基因表達與喉癌病情進展存在一定聯系，可作為喉癌預后指標。Survivin基因表達與bcl-2、p53表達呈正相關，與caspase-3表達呈負相關，可通過調節凋亡相關因子，促進腫瘤發展。