流式技術監測急性白血病微小殘留病的臨床研究

蔣莉梅，馬 慧，李 玲，白曉川

(寧夏醫科大學總醫院血液內科 750004)

現有標準方案已使絕大多數初治急性白血病(acute leukemia,AL)得到緩解。但大部分AL患者疾病復發仍是影響患者長期生存白血病微小殘瘤，及預后的主要問題，一旦復發，治療難度明顯增加。復發的根本原因是患者體內存在白血病微小殘留病(minimal residual disease,MRD)是指AL患者在經誘導治療緩解后用骨髓細胞形態學方法難以檢測出的體內殘留少量白血病細胞的狀態[1]。應用流式細胞數(FCM)監測MRD動態變化能更早發現白血病復發跡象，以便及早臨床干預，減少復發，改善生存。本研究通過回顧性分析應用FCM動態監測成年AL患者在完全緩解(CR)后不同時間段內MRD的變化情況，探討此項技術對判斷AL患者復發風險、評價其預后及指導個體化治療的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2009年9月30日至2016年6月7日在本院確診并行化療達CR的76例監測過MRD的成年AL患者(年齡大于或等于14歲)的臨床資料，其中急性髓細胞白血病(AML)患者(非M3)57例，M1型7例，M2型24例，M4型12例，M5型12例，M6型1例，M7型1例；急性淋巴細胞白血病(ALL)患者19例，B-ALL 14例，T-ALL 3例，T/B-ALL 2例。AML患者中男34例，女23例，中位年齡40歲(14～74歲)。ALL患者中男11例，女8例，中位年齡29歲(15～60歲)。診斷標準及療效評價參照張之南等主編的第三版《血液病診斷及療效標準》[2]。

1.2治療方案 確診患者按照AL的標準化療方案進行誘導治療，其中AML多采用以阿糖胞苷為主的吡柔比星+阿糖胞苷(TA)、米托蒽醌+阿糖胞苷(NA)、伊達比星+阿糖胞苷(HA)等方案，ALL多采用以長春瑞濱+地塞米松(VP)為基礎的吡柔比星+長春瑞濱+培門冬酶+地塞米松(DVLP)、吡柔比星+長春瑞濱+培門冬酶+環磷酰胺+地塞米松(DVLCP)等方案。強化鞏固治療多使用原誘導緩解方案及大、中劑量阿糖胞苷單藥交替化療。

1.3隨訪 隨訪時間自確診時起，至患者復發、死亡或隨訪截止期2017年1月31日。失訪病例隨訪至末次就診時間。定義無進展生存期(RFS)，為患者達CR后至其出現復發、死亡或隨訪截止期。

1.4方法

1.4.1研究方法 搜集76例自2009年10月至2016年6月于本院確診AL并經誘導治療達血液學CR后監測過MRD的成人患者資料，對AML及ALL患者在CR后3、6、12及12個月后MRD陽性及陰性組復發率及RFS進行統計學分析。

1.4.2微小殘留檢測方法 抽取患者CR后不同時間點骨髓液3～4 mL肝素鈉抗凝，采用FCM檢測(流式細胞儀由美國Becton-Dickinson公司生產)，可供選擇的單克隆標記方法有6色、8色及10色熒光分析，以CD45/SSC來設門，定義MRD≥1×10-4為陽性，MRD<1×10-4為陰性。

1.5統計學處理 采用SPSS19.0軟件分析數據，非正態分布的計量資料用中位數表示；計數資料用百分率(%)表示，比較采用χ2或Fisher確切概率法。生存曲線比較使用Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1FCM檢測MRD與骨髓細胞形態學結果比較

2.1.1兩種檢測方法檢出率的比較 76例AL患者檢測MRD同時行骨髓細胞形態學檢查。57例AML患者在隨訪期采用FCM方法內分別檢測1～12次，中位檢測次數 3次，共檢測234例次；其中MRD陽性40例次，陰性194例次，陽性檢出率為17.1%；而骨髓形態學檢測復發僅5例次，CR結果229例次，復發檢出率為2.1%，FCM檢測MRD陽性率高于骨髓形態學檢測復發檢出率(P<0.05)。19例ALL患者在隨訪期內采用FCM方法分別檢測1～9次，中位檢測次數2次，共檢測57例次；其中MRD陽性17例次，陰性40例次，陽性檢出率為29.8%；而骨髓形態學檢測復發僅4例次，CR結果53例次，復發率為7.0%，FCM檢測MRD陽性率高于骨髓形態學檢測復發檢出率(P<0.05)。

2.1.2兩種檢測方法陽性與復發時間比較 骨髓形態學檢測復發的5份AML標本中有1份在提前于形態學3個月發現MRD陽性，另外4份同時發現MRD陽性。骨髓形態學檢測復發的4份ALL標本中有1份在提前于形態學1個月發現MRD陽性，另外3份同時發現MRD陽性。

2.2不同治療階段MRD與復發及無復發生存時間關系

2.2.1AML患者

2.2.1.1AML患者首次CR后3個月 此階段33份標本，MRD陽性組7例，6例均在3個月內復發，1例未復發；MRD陰性組26例，復發5例，其中僅1例在MRD陰性后6個月復發；4例分別在MRD陰性后7～13個月復發。MRD陽性組復發率高于MRD陰性組(P<0.05)。MRD陽性組及MRD陰性組的中位RFS分別為1.0個月(0～12個月)、13.5個月(3～37個月)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 AML患者首次CR后3個月MRD陰性及MRD陽性組的生存曲線圖

2.2.1.2AML患者首次CR后6個月 此階段24份標本均為MRD陰性，復發6例，分別在MRD陰性后4～15個月復發，中位RFS為29.0個月(3～36個月)。

2.2.1.3AML患者首次CR 后12個月 此階段35份標本，MRD陽性5例，復發2例，分別在MRD陽性后1、10個月復發；MRD陰性30例，復發7例，分別在MRD陰性后1、3、4、5、6、12、15個月復發。兩組復發率差異無統計學意義(P=0.586)。MRD陽性組及陰性組的中位RFS分別為5.0個月(4～10個月)、25.0個月(1～35個月)，兩組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 AML患者首次CR后12個月MRD陰性及MRD

2.2.1.4AML患者首次CR 12個月后 此階段142份標本，MRD陽性29例，復發12例(其中10例在MRD陽性后6個月內復發，僅2例分別在MRD陽性后7、21個月復發)；MRD陰性組113例，復發23例(其中僅4例在MRD陰性后6個月內復發；19例分別在MRD陰性后7～36個月復發)。MRD陽性組復發率高于MRD陰性組(P=0.019)。陽性組及陰性組的中位RFS分別為5.0個月(0～24個月)、13.0個月(1～45個月)，兩組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 AML患者首次CR 12個月后MRD陰性及MRD陽性組的生存曲線圖

2.2.2ALL患者

2.2.2.1ALL患者首次CR后 3個月 此階段9份標本，MRD陽性4 例，其中3例分別在MRD陽性后7個月內復發，1例未復發；MRD陰性5例，僅1例在MRD陰性后5個月復發。兩組復發率差異無統計學意義(P=0.206)。MRD陽性組及MRD陰性組的中位RFS分別為4.5個月(0～10個月)、8.0個月(5～16個月)，兩組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 ALL患者首次CR后3個月MRD陰性及MRD陽性組的生存曲線圖

2.2.2.2ALL患者首次CR后6個月 此階段9份標本，MRD陽性4例，其中2例在MRD陽性后2個月內復發；MRD陰性組5例，僅1例在MRD陰性后4月內復發。兩組復發率差異無統計學意義(P=0.524)。MRD陽性組及MRD陰性組的中位RFS分別為3.0個月(0～5個月)、24.0個月(3～27個月)，兩組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 ALL患者首次CR后6個月MRD陰性及MRD陽性組的生存曲線圖

2.2.2.3ALL患者首次CR后12個月 此階段11份標本，MRD陽性4例，其中3例分別在MRD陽性后2個月內復發；MRD陰性7例，均未復發。MRD陽性組復發率高于MRD陰性組(P=0.024)。MRD陽性組及陰性組的中位RFS分別為1.5個月(0～3個月)、10.0個月(3～25個月)，兩組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 ALL患者首次CR后12個月MRD陰性及陽性組的生存曲線圖

2.2.2.4ALL患者首次CR 12月個后 此階段29份標本，MRD陽性6例，均在MRD陽性后15個月內復發；MRD陰性23例，僅3例分別在MRD陰性后5～11個月復發。MRD陽性組復發率高于陰性組(P<0.05)。MRD陽性組及MRD陰性組的RFS分別為10.0個月(0～15個月)、14.0個月(1～24個月)，兩組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 ALL患者首次CR 12個月后MRD陰性及MRD陽性組的生存曲線圖

2.3動態檢測MRD與治療轉歸 57例AML患者檢測出MRD的中位間隔時間為3個月(1～27個月)。其中11例在骨髓形態學復發前出現MRD陽性，中位提前時間為2個月(1～22個月)。7例MRD陽性后，經加強治療MRD轉陰，但部分出現交替轉陽。19例ALL患者檢測出MRD的中位間隔時間為3個月(1～10個月)。其中有3例在形態學復發前出現MRD陽性，中位提前時間為3個月(1～6個月)。

3 討 論

已有研究顯示CR后MRD監測結果是 AL無病生存的獨立預后因素[3-5]。本研究分析了本院76例AL患者在首次CR后3、6、12及12個月后的4個階段MRD結果，顯示MRD陽性組患者的中位RFS較MRD陰性組縮短；且相應階段MRD陽性組生存率較MRD陰性組低，但兩組的復發率并非在各階段都有顯著性差異?？赡苁懿±龜递^少；檢測MRD的時間點及間隔時間無統一規范；部分患者的隨訪時間較短，隨訪期內尚無復發跡象；取材、操作誤差等因素影響。而首次CR后3個月及12個月后MRD陽性患者的復發相對更多，前者可能提示患者體內白血病細胞存在原發耐藥克?。欢笳叨啻位熀笕匀粰z出MRD陰性，提示存在白血病細胞繼發耐藥。目前相關研究相對較少，MARSHALL等[6]通過臨床研究，認為第1、12、24個月時MRD高水平提示復發意義更大，與本研究基本一致。

本研究還顯示，FCM檢測AL患者MRD陽性率較形態學檢測復發率高，多數患者在骨髓形態學復發前即可發現MRD陽性，說明FCM的靈敏度更高，能更早發現AL復發跡象，以便及早采取對策。這與國內外的研究結果基本一致。

有關MRD檢測時間點及時間間隔，目前尚不統一，但普遍認為在AL誘導緩解及鞏固治療后的時間段內檢測對判斷預后意義更大，時間間隔建議是每3個月檢測1次[7-8]。有關檢測MRD的時間間隔，或許根據不同時間段MRD的具體值及變化趨勢來制定，可能對指導患者的后續治療更有幫助。

有關FCM檢測MRD的陽性閾值，眾多研究之間差異較大，從7.5×10-5～1.0×10-2不等，但大多采用的是0.01% 作為 MRD 陽性閾值[9-11]。本研究也是以1×10-4為MRD陽性閾值。此外，單次MRD陽性的患者在隨訪期內并非都出現骨髓形態學復發，而連續數次MRD陽性患者更容易出現骨髓形態學復發；且多次MRD陽性的患者如出現單次MRD陰性則仍需后續的監測。只有連續動態監測MRD水平的變化才能對AL患者的復發及預后判斷提供可靠的臨床依據。此外，部分患者MRD的檢測結果是交替變化的，提示隨著治療的更改，MRD的檢測結果可出現一定程度的變動，所以將FCM檢測MRD結果作為判斷治療效果的惟一指標尚不可取。有條件者應當借助更為靈敏的檢測方法如分子學、基因測序等查找MRD。已有文獻提出增加AL患者緩解及治愈的分子學診斷標準[12-13]。

綜上，FCM動態監測MRD對判斷AL患者的復發、預后及指導個體化治療有較大的臨床價值。但目前MRD檢測時間、間隔時間及陽性閾值等尚無統一標準。此外，提高檢測靈敏度也是亟待解決的問題之一。