三白脂素-8抑制缺氧誘導因子-1α對腎癌細胞解偶聯功能的影響

張永春，谷 江，董安濤，楊錦春

(1.武警貴州總隊醫院外二科，貴陽 550005；2.貴州醫科大學附屬醫院泌尿外科，貴陽 550004)

缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)是惡性腫瘤細胞在抗乏氧環境下保持增殖的重要基因[1]，目前，通過抑制HIF-1α達到抑制惡性腫瘤生長的研究正成為研究熱點[2]。而在HIF-1α的有效抑制劑中，三白脂素-8(manassantin A,Man A)是一種由三白草提純而來植物制劑，對HIF-1α的特異性抑制作用很強[3]，而對正常細胞的毒性作用很小[4]。Man A可影響線粒體呼吸傳遞鏈，抑制細胞線粒體復合物的功能，并降低ATP的產量[3]。線粒體內膜上的線粒體解偶聯蛋白2(uncoupling protein2,UCP2)，通過對線粒體膜通透性轉運孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP) 的穩定調節，使線粒體產能電勢(mitochondrial membrane potential ΔΨm)達到動態平衡平衡，以此調節ATP的生成[5]，并與惡性腫瘤的增殖關系密切[6]。鑒于Man A和UCP2對細胞產能存在可能的相關性，因此本研究將Man A和UCP2一并引入研究，觀察Man A對腎癌細胞的抑制作用并與UCP2的解偶聯功能是否存在聯系，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

腎癌細胞株(GRC-1)購于上海弗雷堡生物公司，Man A由武警后勤學院劉英福博士惠贈，RPMI1640購于Hyclone公司，MTT購于Sigma公司，總RNA提取試劑盒購于Fermentas公司，ELISA試劑盒購于R&D公司，G418購于Solarbio公司，DH5α菌種為貴州醫科大學干細胞實驗室提供相關的限制性內切酶、脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑、質粒抽提試劑盒均購于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 25 cm2培養瓶中將腎癌細胞株置入，使用含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養液，培養瓶外部環境為5%CO2、37 ℃。換液頻率為每2～3天1次，或消化傳代每2～3天1次，當細胞培養生長為對數期時進行后繼試驗。

1.2.2質粒構建及其鑒定

1.2.2.1HIF-1α/pcDNA3.0載體的構建 氯化鈣法制備DH5α大腸桿菌感受態細胞，保存于-70 ℃低溫冰箱。HIF-1α基因的CDS區序列(NM-001530)于NCBI獲得，引物設計使用Primer5.0軟件。上游5′-AAA AAT CTA GAA TGG AGG GCG CCG GCG GCG CGA ACG-3′，下游為5′-CCC CCG GAT CCT CAG TTA ACT TGA TCC AAA GCT CTG-3′，引物合成自大連寶生物公司。 PCR擴增及反應條件：預變性94 ℃、3 min，變性94 ℃、30 s，退火53 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，全程共35個循環。載體及目的基因分別經BamH1和HindⅢ進行雙酶切，將載體與酶切基因按3∶1的摩爾比進行過夜連接，外界環境為16 ℃，設立質粒陽性和陰性對照。取4 μL將連接產物接種于100 μL的DH5α感受態細胞中。挑取單菌落擴增并抽提質粒，使用限制性內切酶BglⅡ進行單酶切鑒定，將重組質粒命名為HIF-1α/pcDNA3.0。

1.2.2.2鑒定重組質粒序列 使用3730XL型DNA自動測序儀測序，由大連寶生物公司進行。

1.2.3質粒轉染 腎癌(GRC-1)細胞的轉染由脂質體介導：細胞株于25 cm2培養瓶中培養，匯合度達到90%后使用胰酶消化，于24孔培養板接種，加入無雙抗RPMI1640及10%胎牛血清，48 h后細胞密度約80%～90%。A液(于147 μL無雙抗、無血清的RPMI1640培養液中加入3 μL質粒，靜置5 min)、B液(于144 μL無雙抗、無血清的RPMI1640培養液中加入6 μL LipofectamineTM2000，靜置5 min)，C液(A液和B液混合為C液)。將C液移入培養板，密度為每孔100 μL，加入無雙抗、無血清的RPMI1640培養液，密度為每孔400 μL。培養6 h后換含10%胎牛雙抗、血清的RPMI1640培養液，24 h后按1∶10給予傳代，24 h后加入含G418的維持液進行篩選，每3～5天換液1次。

1.2.4細胞分組與干預 對HIF-1α/pcDNA3.0、空載體質粒使用脂質體LipofectamineTM2000轉染，對照組為腎癌(GRC-1)細胞，轉染效率提示轉染成功后，構建高表達HIF-1α基因的轉染組腎癌細胞，未行基因干預的GRC-1細胞定義為非轉染組，實驗組及對照組分別使用密度為0、0.1、0.2、0.4 μmol/L的Man A溶液進行干預并依次命名為對照組及低、中、高劑量組。

1.2.5檢測實驗設計指標

1.2.5.1半定量PCR檢測GRC-1細胞內UCP2、HIF-1α的基因表達 待25 cm2培養瓶細胞匯合度達到90%后行分組處理，提取GRC-1細胞總RNA，檢測RNA的完整性與濃度，逆轉錄及合成cDNA。引物序列如下所示：β-actin(正向5′-CCC TGG ACT TCG AGC AAG AGA T-3′，反向5′-GTT TTC TGC GCA AGT TAG G- 3′)，UCP2(正向5′-GAC CTA TGA CCT CAT CAA GG-3′，反向5-GTT TTC TGC GCA AGT TAG G-3′)，HIF-1α(正向5′-TCC AGC AGA CTC AAA TAC AAG AAC-3′，反向5′-GTA TGT GGG TAG GAG ATG GAG ATG-3′)，反應條件為：預變性94 ℃、3 min，變性94 ℃ 、30 s，退火53 ℃ 、30 s，延伸72 ℃、 1 min，進行35個循環，終止反應條件為72 ℃、 5min；于2%瓊脂糖凝膠中對PCR產物進行電泳，經Image J軟件行條帶分析，將檢測基因與β-actin的光密度比值代表所檢測基因的半定量表達。

1.2.5.2ELISA檢測UCP2、HIF-1α的蛋白表達 使用細胞裂解液及PMSF裂解細胞，離心半徑8.5 cm、12 000 r/min對細胞離心5 min，取上清液按每孔50 μL滴加，分別將相應孔板設空白孔、標準孔及待測樣品孔，上述檢測嚴格按照試劑盒說明書的提示操作。

1.2.5.3細胞增殖活性的檢測 將細胞接種于96孔板，密度約104個/孔，均設6個復孔，分組處理24 h后吸棄原有培養基，加5 μg/L的MTT 20 μL及無血清培養基80 μL，孵育4 h(環境為37 ℃)后吸棄培養孔內液體，加入二甲亞砜150 μL后低速震蕩(震蕩時間為10 min)，酶標儀(490 nm)檢測其吸光度(A)值。

1.2.5.4細胞內ATP水平的檢測 分組處理細胞并消化離心后，加入520 μL無血清培養基，再加入520 μL 2%的三氯醋酸后冰浴、離心，時間為5 min。取300 μL上清液、300 μL NADH液、10 μL磷酸甘油醛脫氫酶一磷酸甘油激酶進行混合，檢測NADH下降的A值，根據標準曲線計算ATP的值。

1.2.5.5線粒體提取及鑒定 實驗步驟均于冰面上進行，25 cm2細胞培養瓶中培養細胞匯合度約80%后分組處理，消化離心，裂解，離心半徑9.3 cm、4 000 r/min條件下離心10 min。取上清液，離心半徑8.9 cm、 10 000 r/min條件下離心15 min后棄上清液，收集所得沉淀。將沉淀均勻涂抹于載玻片，加詹納斯綠B染液(0.02%)，浸染10 min，用10×40倍的高倍鏡觀察，重復3次。

1.2.5.6mPTP開放程度的檢測 使用上述方法制備線粒體懸液。將3 mL測定介質P分別加入分組后的線粒體懸液，搖勻。對照組加入的測定介質P為4 mL，分光光度計(752N型)于540 nm測定A值，mPTP開放程度與A值呈負相關。

1.2.5.7ΔΨm的檢測 制備及分組線粒體懸液同上。將6.6 μL Rh123加入線粒體懸液中，避光孵育30 min(37 ℃水浴箱)，熒光分光光度計檢測其(激發光：480 nm，發射光：525 nm)熒光強度，ΔΨm的大小與熒光強度呈負相關。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 對HIF-1α重組質粒的鑒定結果

3730XLDNA測序儀對送檢標本進行測序后符合Genebank上的序列，見圖1。

圖1 HIF-α/pcDNA3.0質粒的部分測序結果

2.2 評價GRC-1細胞質粒轉染的效率

轉染組、非轉染組的HIF-1α半定量表達分別為0.71±0.09、0.42±0.03。轉染組較之非轉染組顯著增高(P<0.01)，證明高表達HIF-1α的腎癌細胞已成功構建，見圖2。

2.3 各實驗指標的檢測結果

2.3.1HIF-1α、UCP2的基因表達結果 轉染組較之非轉染組，HIF-1α基因的表達量顯著增高(P<0.05)。轉染組細胞UCP2基因的表達量雖低于非轉染組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖2 HIF-1α的PCR電泳圖

圖3 HIF-1α、UCP2基因的表達結果

2.3.2Man A干預各組細胞后檢測HIF-1α和UCP2基因表達 非轉染組和轉染組細胞較之對照組，HIF-1α基因在各組細胞的表達隨著Man A劑量的增加而下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。而UCP2基因的亦隨著Man A劑量的增加而逐漸下降，非轉染組可在高劑量組出現顯著下降(P<0.05)。轉染組在中、高劑量組均出現了顯著下降(P<0.05)，見表1和圖4。

A：非轉染組HIF-1α；B：轉染組HIF-1α；C：非轉染組UCP2；D：轉染組UCP2

表1 Man A對各組腎癌細胞內HIF-1α、UCP2基因表達的影響

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

表2 Man A對各組腎癌細胞內HIF-1α、UCP2蛋白表達的影響

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

2.3.3Man A干預細胞后HIF-1α、UCP2的蛋白表達水平 非轉染組和轉染組細胞較之對照組，HIF-1α的蛋白表達量隨Man A劑量的增加而下降，非轉染組除低劑量組外，其余各組HIF-1α蛋白表達量差異均有統計學意義(P<0.05)；與對照組相比，非轉染組和轉染組細胞各劑量組UCP2蛋白的表達量，隨著Man A劑量的增加而逐漸下降，但均僅在高劑量組出現明顯差異(P<0.05)，見表2。

2.3.4Man A干預各組細胞后檢測細胞內ATP水平 非轉染組和轉染組細胞較之對照組，細胞內ATP水平隨著Man A劑量的增加而下降，在高劑量組出現明顯差異(P<0.05)，見表3。

表3 Man A對各組細胞內ATP水平的影響

a：P<0.05，與對照組比較

2.3.5Man A干預各組細胞后檢測細胞增殖活性 各實驗組較之對照組，其A值均增高，且隨著Man A劑量的增加而逐漸下降，兩組細胞在中、高劑量組均出現顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 Man A對各組腎癌細胞增殖活性的影響

a：P<0.05，與對照組比較

2.3.6線粒體在鏡下的形態學鑒定 根據染色(詹納斯綠B)結果顯示：細胞中提取的線粒體在外形上呈圓形、橢圓形和桿狀，見圖5。

2.3.7Man A干預各組細胞后mPTP的變化情況 與各自的對照組相比，兩組細胞隨著Man A給藥濃度的逐漸增加吸光度逐漸降低。非轉染組的中、高劑量組，轉染組3個實驗組差異均有統計學意義(P<0.05)。A值在各轉染組中顯著高于相同劑量非轉染組(P<0.05)。

圖5 線粒體的鏡下染色(×400)

組別n 非轉染組A值轉染組A值對照組60.097±0.0240.253±0.029 低劑量組60.092±0.0160.194±0.033a中劑量組60.075±0.028ab 0.141±0.046ab高劑量組60.063±0.031ab 0.093±0.027abc

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

2.3.8ΔΨm在Man A干預細胞后的變化 各實驗組隨著Man A給藥濃度的增加，其熒光強度亦增強，與對照組比較，中、高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 細胞行Man A干預后ΔΨm的變化

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

3 討 論

惡性腫瘤的能量代謝、細胞增殖、凋亡等在很大程度上依賴HIF-1α來維持[7]。機體低氧狀態時，HIF-1α生成增加，以維持細胞的氧自穩和能量代謝平衡[8]。HIF-1α是公認的腫瘤適應低氧環境重要調節劑[9]，缺氧環境可促使HIF-1α在細胞中穩定表達，促進腫瘤發生轉移等惡性傾向，產生放化療抗藥性[10]。目前，國內外針對有效抑制HIF-1α的功能，達到抑制腫瘤生長的研究逐漸成為熱點[2]，但尚未針對腎癌細胞進行過相關研究。因此，本實驗將HIF-1α的植物抑制劑Man A引入了腎癌細胞的研究中。

Man A于1983年首次被報道從三白草中提取出的一種雙新木脂體，在亞洲國家作為傳統中藥運用于治療水腫、黃疸、淋病等多種疾病[12]。多項研究均證實Man A對HIF-1α有強烈的抑制作用[3]，有研究報道發現Man A可影響線粒體呼吸傳遞鏈(ETC)，抑制細胞線粒體復合物的功能，并降低ATP產量[5]。線粒體解偶聯蛋白2(UCP2)是線粒體內膜上的一種質子轉運蛋白，介導跨線粒體內膜的質子流，使呼吸鏈與ATP產生解偶聯[13]，是線粒體呼吸功能、ATP生成的關鍵調節蛋白。基于Man A、UCP2均對線粒體內外膜電勢、ATP生成等有生理作用具有功能上的交叉點，故本實驗將UCP2作為Man A干預腎癌細胞后的觀察指標，判斷UCP2是否在Man A干預腎癌細胞后出現改變，以資推斷Man A抑制HIF-1α后，UCP2是否參與其作用機制。

實驗結果提示，成功構建高表達HIF-1α的腎癌細胞株中UCP2的基因表達量出現了上升趨勢，但未出現顯著差異，提示HIF-1α的表達增高和UCP2無明顯關系；當實驗中給予Man A進行干預后，HIF-1α的基因及蛋白表達量均出現顯著下降，符合Man A作為HIF-1α阻斷劑的理論前提。UCP2的基因及蛋白表達量出現下降趨勢，特別是在高劑量Man A干預后出現了顯著下降，這可能與Man A影響了線粒體膜電勢，并降低ATP的生成，負反饋于UCP2造成，亦可能是Man A直接作用于UCP2，降低其基因及蛋白的表達。但此項結果尚需對UCP2的基因進行調控并完善其他指標后才能明確判定。在檢測細胞ATP產量時發現，隨著Man A干預劑量的不斷增加，兩組細胞的ATP水平逐漸減少，在高劑量組可出現顯著下降，符合以往研究對Man A生理功能的描述。為了探討Man A對腎癌細胞ATP產量影響的具體機制，本研究檢測了線粒體解偶聯功能相關指標mPTP及ΔΨm。實驗結果提示，Man A可提高mPTP開放程度，并導致ΔΨm的降低，并因此降低了線粒體內外膜電勢，造成ATP產量的減少。這一現象與UCP2表達降低的結果是符合的。線粒體解偶聯功能的改變可能是Man A抑制了UCP2的表達造成，亦有可能是Man A直接作用于線粒體后導致，且并不能判斷是否因Man A抑制了HIF-1α后帶來的產能影響。需進一步實驗明確。

HIF-1α有利于腎癌細胞在低氧環境下的生存[14]，而找到抑制HIF-1α的藥物對于腫瘤的生長勢必能產生負向調節的作用。Man A屬三白草屬提取的植物制劑，目前有較多的萃取及合成方法[15]，長期運用于其他疾病的治療，未見不良反應的報道。結合以往研究以及本實驗的結果證實，Man A可有效抑制HIF-1α及腎癌細胞的生長和產能，其具體作用機制與線粒體解偶聯功能關系密切，但其具體作用與UCP2的關系尚需進一步研究證實，這也為本課題組下一步的實驗提出了方向和要求。