組織蛋白酶S對RA軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原的研究

趙進軍,黃 琴,任 昊,歐陽晴晴,毋 靜,楊 敏△

(南方醫科大學：1.南方醫院風濕免疫科；2.珠江醫院風濕免疫科，廣州 510515)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)發病機制復雜，至少有8種類型細胞參與，包括肥大細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、T細胞[1]、B細胞[2]、樹突狀細胞[3]、軟骨細胞和破骨細胞。在正常滑膜中肥大細胞約占滑膜表面細胞的3%；而在RA患者滑膜中肥大細胞數量可占到滑膜表面細胞的5%，說明肥大細胞在RA疾病中起重要作用[4]。RA的主要病理改變是關節軟骨和骨的破壞。因此，針對RA的治療，除控制炎癥外，就是尋求保護軟骨的方法。軟骨基質主要由Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ膠原組成，其中Ⅱ型膠原(CⅡ)的半衰期最長[5]。本研究將肥大細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和軟骨細胞共培養，以期發現對軟骨細胞分泌CⅡ影響最大的細胞類型。由于肥大細胞可分泌多種蛋白酶，本研究擬通過肥大細胞的穩定劑、激活劑和酶抑制劑，以期發現組織蛋白酶S是否對CⅡ的破壞存在作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

本實驗所用動物均為8～9周齡C57BL/6雌性小鼠，在SPF級動物所飼養，符合南方醫科大學動物管理條例，用膠原誘導的關節炎(CIA)進行造模，造模成功后進行原代細胞的培養。DMEM培養基，RPMI 1640培養基，胎牛血清購自Gibco公司；Ⅳ型膠原酶，色甘酸二鈉(DSCG)，肥大細胞的激活劑(C48/80)，脂多糖(LPS)購自Sigma公司；Anti-Cathepsin S抗體、Anti-Collagen Ⅱ抗體，GAPDH抗體購自Abcam公司；組織蛋白酶S的ELISA試劑盒購自LifeSpan公司；CⅡ ELISA試劑盒購自武漢華美；Transwell培養板購自Corning；其余均為國產分析純。LHVS由哈佛大學的施國平教授贈送。

1.2 方法

1.2.14種原代細胞的培養方法

滑膜成纖維細胞和關節軟骨細胞的原代培養使用0.3%的Ⅳ型膠原酶消化法。腹腔巨噬細胞使用3%的Thioglycollate肉湯。骨髓源性肥大細胞的原代培養使用終濃度為10 g/mL的重組小鼠IL-3和SCF刺激。

1.2.2軟骨細胞和滑膜成纖維細胞共培養 軟骨細胞和滑膜成纖維細胞共培養分4組：軟骨細胞對照組、軟骨細胞+滑膜成纖維細胞組、軟骨細胞+滑膜成纖維細胞+TNF-α低劑量刺激組(終濃度10 μg/mL)、軟骨細胞+滑膜成纖維細胞+TNF-α高劑量(終濃度100 μg/mL)刺激組。選取Transwell小室12孔板，每組設3個復孔，細胞按3×105/mL濃度加入Transwell小室，共培養24 h和48 h。

1.2.3軟骨細胞和巨噬細胞共培養 軟骨細胞和巨噬細胞共培養分4組：軟骨細胞對照組、軟骨細胞+巨噬細胞激活組(LPS的終濃度為100 ng/mL)、軟骨細胞+巨噬細胞+LHVS(終濃度10 ng/mL)組、軟骨細胞+巨噬細胞+E64(終濃度20 μmol/L)組。巨噬細胞和軟骨細胞分別按2×106/mL和3×105/mL濃度加入Transwell小室的內孔，其中巨噬細胞的激活使用LPS(終濃度100 ng/mL)，共培養24 h和48 h。

1.2.4軟骨細胞和肥大細胞共培養 軟骨細胞和肥大細胞共培養分6組：軟骨細胞對照組、軟骨細胞+肥大細胞共培養對照組、軟骨細胞+肥大細胞+DSCG(終濃度10 μmol/L)組、軟骨細胞+肥大細胞+C48/80(終濃度5 μg/mL)組、軟骨細胞+肥大細胞+LHVS組、軟骨細胞+肥大細胞+E64組。肥大細胞和軟骨細胞分別按1×106/mL和3×105/mL濃度加入12孔板，共培養24 h和48 h。

1.2.5ELISA檢測培養上清液中組織蛋白酶S和CⅡ的表達 培養上清液中組織蛋白酶S和CⅡ的ELISA檢測方法按試劑盒說明書進行，每個樣品檢測3次。

1.2.6RT-PCR檢測軟骨細胞中CⅡ mRNA RT-PCR檢測軟骨細胞中CⅡ mRNA：提取總RNA，檢測總RNA的完整性，去除DNA，加入PCR引物(CⅡA1：5′-CCT GTT CTG AGA GGT CTT CCT G，5′-AAT ACC AGC AGC TCC CCT CT，GAPDH：5′-AGA AGG TGG TGA AGC AGG CAT C，5′-CGA AGG TGG AAG AGT GGG AGT T)，反應后每一個樣品目的基因擴增的循環數(Ct)都依據GAPDH做校正。

1.2.7Western blot檢測組織蛋白酶S的表達 用lysis buffer冰上裂解細胞，獲得總蛋白，常規方法進行電泳、轉膜、封閉、抗體、顯色等。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 細胞共培養時CⅡ的表達

小鼠關節軟骨細胞和滑膜成纖維細胞共培養用TNF-α刺激時，CⅡ表達的結果見圖1A，各組間沒有統計學差異。軟骨細胞和腹腔巨噬細胞共培養時CⅡ表達的結果見圖1C，軟骨+巨噬細胞激活組與其他組間差異有統計學意義(P<0.05)，加用組織蛋白酶S的抑制劑后，LHVS和E64組CⅡ的表達均升高，與軟骨細胞對照組間差異無統計學意義。軟骨細胞和骨髓源性肥大細胞共培養時CⅡ表達的結果見圖1E，軟骨+肥大+C48/80組與其他各組間差異有統計學意義(P<0.05)，而在加入組織蛋白酶S的抑制劑后，CⅡ的表達恢復正常。

2.2 細胞共培養時組織蛋白酶S的表達

軟骨細胞和腹腔巨噬細胞共培養時組織蛋白酶S表達的結果見圖1G，軟骨+巨噬細胞激活組與其他組間差異有統計學意義(P<0.05)，加用組織蛋白酶S的抑制劑后，LHVS和E64組內組織蛋白酶S的表達均降低。軟骨細胞和肥大細胞共培養時組織蛋白酶S表達的結果見圖1H，軟骨+巨噬細胞激活組與其他各組間差異有統計學意義(P<0.05)，加用組織蛋白酶S的抑制劑LHVS和E64后，組織蛋白酶S表達降低，與軟骨+肥大對照組間差異無統計學意義。

A：小鼠軟骨細胞與滑膜成纖維細胞共培養時CⅡ的ELISA結果；B：小鼠軟骨細胞與滑膜成纖維細胞共培養時CⅡ的RT-PCR結果；C：小鼠軟骨細胞與巨噬細胞共培養時CⅡ的ELISA結果；D：小鼠軟骨細胞與巨噬細胞共培養時CⅡ的RT-PCR結果；E：小鼠軟骨細胞與肥大細胞共培養時CⅡ的ELISA結果；F：小鼠軟骨細胞與肥大細胞共培養時CⅡ的RT-PCR結果；G：巨噬細胞與軟骨細胞共培養時組織蛋白酶S的ELISA結果；H：肥大細胞與軟骨細胞共培養時組織蛋白酶S的ELISA結果；a:P<0.05;1：軟骨；2：軟骨+滑膜；3：軟骨+滑膜+TNF低；4：軟骨+滑膜+TNF高；5：軟骨；6：軟骨+巨噬；7：軟骨+巨噬+LHVS；8：軟骨+巨噬+E64；9：軟骨；10：軟骨+肥大；11：軟骨+肥大+DSCG；12：軟骨+肥大+C48/80；13：軟骨+肥大+LHVS；14：軟骨+肥大+E64

圖1細胞共培養結果

2.3 細胞共培養時RT-PCR結果

本研究對軟骨細胞和其他3種類型的細胞共培養，進行了CⅡ的RT-PCR檢測，不管是和滑膜成纖維細胞(圖1B)，腹腔巨噬細胞(圖1D)，還是和骨髓源性肥大細胞(圖1F)，各組間均差異無統計學意義。

A：軟骨細胞和巨噬細胞共培養時的結果；B：軟骨細胞和肥大細胞共培養時的結果

圖2組織蛋白酶S的Western blot結果

2.4 Western blot結果

本研究對軟骨細胞和腹腔巨噬細胞共培養、軟骨細胞和骨髓源性肥大細胞共培養，提取總蛋白，Western blot結果見圖2。巨噬細胞和肥大細胞分別被LPS和C48/80激活后，組織蛋白酶S的表達升高，而用組織蛋白酶S的抑制劑LHVS和E64可以抑制其表達。

3 討 論

組織蛋白酶S是一種屬于木瓜蛋白酶超家族的半胱氨酸蛋白酶，在抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APCs)上高度表達，它對多種蛋白具有催化水解活性，特別是MHC Ⅱ恒定鏈(invariant chain，Ii)和細胞外基質成分(彈性蛋白和膠原)。已證實組織蛋白酶S參與多種疾病，如阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病、腫瘤、骨關節炎、神經痛和多種自身免疫性疾病[6-7]等。但目前對組織蛋白酶S在RA中的作用研究較少[8]。

組織蛋白酶 S的底物廣泛[9]，最引起人們興趣的是它的高彈性蛋白水解活性[10]。但在類風濕關節炎中可能無關彈性蛋白的降解，因為在骨和軟骨的細胞外基質中彈性蛋白水平極低。但組織蛋白酶 S有潛在的蛋白聚糖降解活性，特別是在中性和酸性pH中具有強大的水解軟骨聚集蛋白聚糖能力[11]。組織蛋白酶 S在RA關節的滑膜巨噬細胞上表達，在炎性過程中分泌蛋白酶入軟骨基質，可能會破壞形成功能性軟骨的軟骨聚集蛋白聚糖-CⅡ網狀組織的完整性[12]。但目前很少有人研究組織蛋白酶S對軟骨細胞分泌CⅡ的影響[13]。

本研究共進行了4種原代細胞的培養，包括小鼠滑膜成纖維細胞、腹腔巨噬細胞、關節軟骨細胞和骨髓源性肥大細胞。發現軟骨細胞在與滑膜成纖維細胞共培養時，軟骨細胞分泌CⅡ的量無變化。而軟骨細胞與巨噬細胞共培養時，及軟骨細胞與肥大細胞的共培養時，均發現CⅡ的量減少，尤其是在肥大細胞被其激活劑(C48/80)激活后。該研究證實巨噬細胞和肥大細胞是組織蛋白酶S的主要來源，本研究在該研究中當加入組織蛋白酶S的特異性抑制劑(LHVS)及非特異性抑制劑(E64)后，CⅡ的量恢復到正常水平，說明組織蛋白酶S可能是CⅡ量減少的主要因素。但細胞培養上清中CⅡ量減少是由于分泌減少還是分泌后被破壞需深一步研究。隨后收集各組軟骨細胞，裂解提取RNA后進行CⅡ的RT-PCR檢測，發現各組間RT-PCR水平相似，說明CⅡ在轉錄水平上未發生變化，因此認為CⅡ主要是在合成后受到破壞。當然，本研究中還存在不足，即未對組織蛋白酶S的活性進行檢測，不能反映組織蛋白酶S在病變中的功能變化，這將是下一步研究的重點。

從本研究上看，巨噬細胞和肥大細胞均對軟骨細胞分泌CⅡ的影響較大，他們可能是影響軟骨功能的主要細胞類型，而在抑制了組織蛋白酶S功能后，CⅡ的分泌量恢復正常，說明組織蛋白酶S很有可能是CⅡ破壞的主要因素，因此針對組織蛋白酶S的特異性治療有可能是未來研究的方向。