逆行吻合神經法重建皮瓣感覺功能的實驗研究

2018-12-28 07:40:30余曉軍陳雪松徐永清王曉鳳

重慶醫學 2018年34期

余曉軍,陳雪松,徐永清,王曉鳳,吉麗,劉亞

(1.中國人民解放軍第五十九中心醫院創傷顯微外科,云南開遠 661699;2.中國人民解放軍昆明總醫院全軍骨科中心,昆明 650000)

臨床及基礎研究證明，重建皮瓣感覺具有重要意義[1-3]，可明顯減少破潰及感染等遠期并發癥，增加皮瓣耐磨性[4]。因其與未重建感覺皮瓣相比，除了通過外周途徑機制，還通過中央途徑機制恢復皮瓣感覺[5]。目前臨床中重建皮瓣感覺方法有神經植入法及神經吻合法，后者其實為順行吻合皮瓣原近端皮神經重建皮瓣感覺的方法，因為少有逆行吻合皮瓣遠端皮神經重建皮瓣感覺的報道。隨著顯微外科的發展及“追求正?！钡睦砟畹耐茝V，很多皮瓣，如游離的遠端蒂的小腿后外側皮神經營養血管皮瓣等，難以采用順行吻合神經法重建皮瓣感覺，而逆行吻合神經法則很容易。但其能否像前者一樣恢復皮瓣良好感覺？為此，本研究建立了該重建皮瓣感覺方法的動物模型，并利用抗NF抗體免疫組化法，在光鏡下觀察皮瓣感覺神經末梢再生情況，從組織形態學上觀察該方法的療效，為進一步推廣臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

健康豚鼠100只，雌雄不限，體質量為280～320 g，由昆明醫科大學動物實驗中心提供。苯巴比妥鈉(福建省閩東九捷迅藥業有限公司)；4%多聚甲醛(蘇州澤科生物技術有限公司)；蔗糖(Sigma公司，美國)；明膠(東莞市新成明膠有限公司)；0.01 mmol/L PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液(福州邁新生物技術開發有限公司)；TritonX-100溶液(Sigma公司，美國)；抗神經絲鼠單克隆抗體(福州邁新生物技術開發有限公司)；抗鼠抗體(福州邁新生物技術開發有限公司)；卵白素溶液(Sigma公司，美國)； DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)。顯微器械(寧波市成和顯微器械廠)；顯微鏡(寧波市成和顯微器械廠)；冰凍切片機Leica1950(北京中儀光科科技發展有限公司)；載玻片(福州邁新生物技術開發有限公司)；冰箱(青島海爾集團公司)；光學顯微鏡(上海富萊光學科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗動物分組將100只豚鼠按手術時對皮瓣神經處理方式，分為A組(逆行吻合神經組)、B組(順行吻合神經組)、C組(無神經組)、D組(正常組)4組，A、B、C組各隨機挑選30只豚鼠，D組10只。A組采用逆行吻合皮瓣內神經重建皮瓣感覺；B組采用順行吻合皮瓣內神經重建皮瓣感覺；C組切除皮瓣近端長約1.5 cm神經；D組直接切取皮瓣行抗神經絲抗體免疫組織化學法檢查。

1.2.2皮瓣設計與制作用苯巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉成功后，剔除豚鼠乳頭以遠左后肢毛發，聚維酮碘消毒，鋪無菌巾。以后肢內側中點為蒂部，隱神經走形為軸線，設計一大小約2.0 cm×2.0 cm隱神經營養血管皮瓣(圖1A)。按設計線切開皮膚，從四周向軸線及蒂部深筋膜層切取皮瓣，顯微鏡下分離，勿損傷隱神經伴行動靜脈穿向皮瓣內的分支，最后皮瓣僅與近端蒂部相連。A組在皮瓣以遠的軸線上，做一長約2.2 cm切口，游離出隱神經及伴行血管2.2 cm,在其遠端離斷，血管用9-0顯微縫合線予以結扎。然后在蒂部游離出隱神經，予以離斷，將遠端隱神經旋轉180度，通過皮瓣與蒂部隱神經近端用10-0顯微縫合線，端端吻合(圖1B、C)。皮瓣遠側端所帶神經與受區神經吻合的方式稱為逆行吻合。B組皮瓣在蒂部游離出隱神經，并予以離斷，然后用10-0顯微縫合線，端端吻合(圖1D、E)。皮瓣近側端所帶神經與受區神經吻合的方式稱為順行吻合。C組皮瓣在蒂部游離出一長約1.5 cm隱神經，并予以切除(圖1F、G)。D組為直接切取皮瓣行免疫組化檢查。為避免術后吻合神經端端裂開，A、B組用石膏固定術肢。術后3 d，每天腹腔注射一次青霉素(10萬U)預防感染治療。為避免外周途徑的長入，分別在術后第1、2、3個月末前2周，在A、B、C組各選取10只豚鼠，消毒鋪單，將A、B、C組皮瓣沿原切口切開至肌層后，縫合切口(圖1H、I、J)。術后處理同前。然后在術后第1、2、3個月末，將各組皮瓣原位游離，行抗神經絲抗體免疫組織化學檢查。

A：皮瓣設計;B、C：A組方法;D、E：B組方法;F、G：C組方法；H、I、J：將愈合良好的A、B、C組皮瓣沿原切口切開至肌層后，縫合切口；黃色箭頭：神經吻合處

圖1實驗中所用手術方法

1.3 觀測指標

A～C：A組、B組及C組1個月時神經再生情況；D～F：D組神經分布情況；G～L：A組、B組及C組2個月時神經再生情況；M～R：A組、B組及C組3個月時神經再生情況；藍色箭頭：神經干內再生神經；綠色箭頭：真皮層形成的神經網叢；紅色箭頭：毛囊感受器；黃色箭頭：表皮層內形成的游離神經末梢

圖2各組感覺末梢術后1、2、3個月形態學觀察結果

1.3.1大體觀察麻醉后保暖，觀察呼吸及蘇醒狀況。手術后觀察豚鼠精神及飲食情況，觀察固定肢體石膏是否松動，皮瓣循環是否良好，縫合口是否出現感染等征象。

1.3.2感覺末梢形態學觀察有毛動物肢體皮瓣感覺恢復的客觀指標，主要取決于游離神經末梢與毛囊感受器(超微結構)再生的數量，與數量成正比。在觀察有毛動物皮膚超微結構的方法中，主要有免疫組化法和改良Biedschowsky銀染法，本研究選擇抗神經絲抗體免疫組化法+光鏡觀察豚鼠各種重建感覺方法的皮瓣的感覺末梢形態學觀察。具體方法步驟如下：(1)離體皮瓣立即放入4%多聚甲醛中固定12 h(4 ℃)；(2)侵入20%蔗糖溶液8～12 h脫水處理(4 ℃)；(3)樣本做50微米厚冰凍切片，并保持每個樣本切取量的總長度為200 mm,載玻片預先用1∶100的明膠液做防脫片處理；(4)0.01 mmol/L PBS液簡洗切片；為增加膜通透性，室溫下0.3% TritonX-100溶液孵育0.5 h；(5)用1∶4 000抗NF單克隆抗體4 ℃孵育3 d；(6)1∶150抗鼠抗體室溫6 h；(7)用DAB加強染色法顯色；(8)光鏡下觀察感覺末梢再生情況，陽性神經纖維呈藏藍色束狀或絲狀結構，背景呈淡棕色或棕色。

2 結果

2.1 大體觀察情況

所有豚鼠麻醉后經保暖，均順利蘇醒，術后第2日正常飲食，精神狀況好，所有豚鼠均成活。C組1只豚鼠皮瓣發生完全壞死，考慮無穿支血管進入皮瓣所致；B組1只豚鼠皮瓣發生感染，周緣出現壞死；其余豚鼠皮瓣均成活，未發生感染及壞死。A、B組豚鼠石膏未出現松動斷裂，固定有效。

2.2 光鏡下各組皮瓣內感覺末梢形態學觀察結果

2.2.1術后1個月 A組：逆行吻合神經反折段已有神經纖維再生，但未達到皮瓣內原有神經近側端，皮瓣內神經末梢潰變，神經周圍未見神經再生現象(圖2A)。 B組：皮瓣內原有新生神經纖維長入，神經周圍未見顯著神經再生現象，表皮內未見游離神經末梢及毛囊感受器形成(圖2B)。 C組：皮瓣原有神經纖維及神經末梢部分潰變，無再生神經纖維形成，神經末梢密度較正常降低(圖2C)。D組：皮瓣神經干內神經纖維分布均勻，皮瓣真皮層可見大量神經網叢，表皮層可見游離神經末梢及毛囊感受器存在(圖2D、E、F)。

2.2.2術后2個月 A組：皮瓣內原有及反折段神經均有新生神經纖維長入，密度較正常稍低，并以神經為中心，真皮層可見神經網叢，表皮下可見游離神經末梢，密度未達正常，皮瓣周緣未見神經再生現象(圖2G、H)。 B組：皮瓣內原有新生神經纖維密度較術后1個月時明顯增加，神經周圍真皮層神經網叢形成，表皮可見游離神經末梢，密度未達正常，皮瓣周緣未見神經再生現象(圖2I、J)。C組：皮瓣原有神經纖維及神經末梢完全潰變，無再生神經纖維形成，神經末梢密度較正常明顯降低(圖2K、L)。

2.2.3術后3個月 A組：皮瓣內原有及反折段神經新生神經纖維完全長入，橫切面神經纖維密度接近正常，除神經周圍外，皮瓣周緣真皮層可見神經網叢，表皮下可見游離神經末梢及毛囊感受器，密度與正常相仿(圖2M、N)。B組：皮瓣內原有新生神經纖維密度接近正常，皮瓣周圍亦可見真皮層神經網叢形成，表皮可見游離神經末梢及毛囊感受器，密度與正常相仿(圖2 O、P)。C組：皮瓣原有神經纖維及神經末梢完全潰變，無新生神經纖維再生，神經末梢密度極低，與其他組結果有明顯區別(圖2Q、R)。

3 討論

3.1 建模背景

2001年柴益民等[6]將穿支皮瓣與皮神經營養血管皮瓣原理結合，提出了動脈穿支蒂皮神經營養血管皮瓣的概念。該類皮瓣質地適中，不損傷主干血管，皮瓣內所帶皮神經為重建感覺創造條件。臨床中在修復感覺恢復要求高的手足部創面時得到大量運用[7-13]。本研究采用腓動脈穿支蒂小腿后外側皮神經營養血管皮瓣游離移植修復手足部創面時，為更能遵循“受區修復重建好，供區破壞損失少，成活可靠，操作簡單易行”的皮瓣設計原則，本研究多選擇小腿中下段穿支，并向近端設計皮瓣，爭取供區直接縫合或少植皮，減少供區植皮的并發癥。此時，要重建皮瓣感覺，因皮瓣近端皮神經與穿支血管方向相反，距離遠，不利于順行吻合，臨床中，選擇了逆行吻合法，通過隨訪，亦取得了良好療效。但查閱文獻，缺乏逆行吻合神經法重建皮瓣感覺的基礎研究方面的證據。

3.2 臨床意義

本實驗通過建立逆行吻合神經組、順行吻合神經組、不吻合神經組及正常皮膚組的動物模型，再采用抗神經絲抗體免疫組化法，光鏡下比較各組結果發現：(1)采用逆行吻合神經法與順行吻合神經法重建皮瓣感覺，最終均能形成與人類皮膚感覺神經末梢相似的游離末梢及毛囊感受器，皮瓣有效重建感覺，并以中央途徑的機制恢復；(2)實驗中排除外周途徑機制恢復感覺的影響后發現，不管是通過逆行吻合神經法還是順行吻合神經法，重建皮瓣感覺的效果均優于不吻合神經的皮瓣感覺恢復效果。證明了逆行吻合神經法重建皮瓣感覺的可行性，彌補了基礎研究的理論基礎，可為后期進行相關研究提供理論依據。更重要的是，為臨床應用提供了指導意見:本實驗表明，神經纖維不像肢體粗大淺靜脈，存在某種阻礙逆行傳導的因素，而像電線，不管從那端通電，都可以傳輸軸漿流，到達終末感受器，形成有效感覺。因此對于臨床中需重建感覺的皮瓣，如臨床使用較多的蒂部設計在皮瓣遠端的腓動脈穿支小腿后外側皮神經營養血管皮瓣，因解剖原因及美觀要求，難以采用順行吻合神經法重建皮瓣感覺，有上述結論，可以果斷選擇逆行吻合神經法重建皮瓣感覺，去避開解剖限制及達到美觀要求。臨床中，經常遇到受區所需皮瓣修復的面積大，通過單一吻合神經難以讓皮瓣所有區域獲得感覺恢復，為減少術后并發癥，應將皮瓣內皮神經走形部分設計在關鍵區，如易受壓及受摩擦的區域；為盡量擴大感覺恢復面積，應將皮瓣內皮神經走形部分設計在受區缺乏神經分布的區域，離皮神經支配部位較遠的皮瓣部分設計在神經分布豐富的區域。對于臨床中皮瓣難通過外周途徑機制獲得感覺，如皮瓣較大較厚，創基缺乏神經[14]，而受區又需較好感覺恢復情況下，選擇逆行或順行吻合皮瓣內神經至關重要，應作為術前計劃的重要部分。

3.3 建模要點

(1)選擇建模動物時，應以性情溫和，便于術后觀察皮瓣，神經有合適直徑，便于術中吻合，保證手術效果為原則。豚鼠滿足上訴條件，且價格適中，所以我們選擇其為建模動物，大白鼠及小白鼠因性情差及個體小而不適合。(2)切取豚鼠隱神經營養血管皮瓣時，術中探查見后肢上1/2段隱神經伴行血管穿支少或缺如，設計皮瓣時蒂部應該選擇在后肢中段以遠，以確保皮瓣循環。(3)豚鼠行走過程中，隨著關節的位移，神經吻合口可能發生斷裂，影響手術療效，因此，固定術肢關節對確保手術效果至關重要。(4)切取樣本行抗神經絲抗體免疫組化法檢查前2周，切開原皮瓣周緣具有必要性，因為對于豚鼠厚度較薄面積較小的皮瓣，本身通過外周途徑亦可恢復良好感覺恢復[15]。術前2周切開皮緣，可減少外周途徑產生的影響。